Vev-spesifikk analyse av en hårsekken regenerering modellen bruker lentivirus å megle gevinst-eller tap av funksjon.
Hårsekken morphogenesis, en kompleks prosess som krever samhandling mellom epitel-avledet keratinocytter og den underliggende mesenchyme, er en attraktiv modell for å studere orgel utvikling og vev-spesifikk signalering. Selv hårsekken utvikling er genetisk medgjørlig, rask og reproduserbar analyse av faktorer avgjørende for denne prosessen er fortsatt en utfordring. Her beskriver vi en prosedyre for å generere målrettet overekspresjon eller shRNA-mediert knockdown faktorer som bruker lentivirus i en vev-spesifikk måte. Ved hjelp av en modifisert versjon av et hår regenerasjon modell 5, 6, 11, kan vi oppnå robust gevinst-eller tap av funksjon analyse i grunnskolen mus keratinocytter eller dermal celler for å lette studie av epitelial-mesenchymale signalveier som fører til hårsekken morphogenesis . Vi beskriver hvordan du isolerer ferske primære mus keratinocytter og dermal celler, som inneholder dermal papilla celler og deres forløpere, levere lentivirus containing enten shRNA eller cDNA til en av cellepopulasjoner, og kombinere cellene å generere fullt dannet hårsekkene på ryggen av nakne mus. Denne tilnærmingen gjør analyse av vev-spesifikke faktorer som kreves for å generere hårsekkene innen tre uker, og gir en rask og praktisk følgesvenn til eksisterende genetiske modeller.
Hår reconstitution analyser gir en unik organ gjenfødelse modell for å undersøke mekanismen av de novo hårsekken formasjon. Her beskriver vi en modifisert kammer hår assay nyttig for å bestemme genfunksjon i hårsekken formasjon. Vår analysen er basert på den rapporterte kammer håret rekonstituering assay 5, 6,11, som vi modifisert for å introdusere en lentiviral uttrykk teknikk for å oppnå genet overekspresjon eller knockdown i enten dermal eller epidermal celletyper. Vår analyse gir en rask alternativ til å generere vev-spesifikk genetisk knockout. Denne analysen kan vi demonstrere gen-funksjon hos hårsekken formasjonen i så lite som tre uker fra å infisere primære celler med lentivirus å pode samling. Vår Analysen kan bli utvidet til å adressere genetiske interaksjoner med kombinasjon shRNA / cDNA produksjonstid ved lentivirus inn en celletype 12, samt tillater undersøkelse av signalering mellom dermal og epidermal celle types.
Vårt hår analysen er best egnet for å oppdage sterke gevinst-eller tap av funksjon fenotyper i hårsekken gjenfødelse, mens subtile feil er vanskeligere å observere. Vi har demonstrert dermal spesifikt gen funksjon av noen få gener ved hjelp av vår hår regenerasjon analysen 1,12. Basert på GFP markør co-uttrykt fra lentivirus vektor uttrykker shRNA 10, viste vi at shRNA uttrykker donor dermal celler fortsatte i de regenererte hår grafts. GFP-positive celler var tilstede i dermal papilla (DP) på de regenererte hårsekkene (Figur 3). DP cellene sannsynlig besto av ulike nivåer av genet knockdown som celler uttrykt varierende grad av GFP, og dermed den observerte hårsekken fenotypen var et utvalg fra genetisk hypomorph til null.
Én forbedring for denne analysen vil være å etablere en rask og effektiv seleksjon for de høye shRNA uttrykkende celler før grafting for eksempel ved hjelp FACS å rense sterke GFP-uttrykke celler. Et alternativ er å erstatte mutant eller betinget knockout celler i denne analysen 9. På den annen side, er en kultur-system som kan bevare DP cellefunksjon svært nyttig som DP potens er gradvis tapt når de primære dermal celler passaged. Potensielle kultur systemer inkluderer bruk av biomaterialer avledet fra kunstig nisje eller aggregering kulturer 2,7,8,13. En annen forbedring vil være å generere en pålitelig epidermal celle frysemetode med høy celle utvinningsgrad da dette vil redusere bruken av det andre settet med mus valpene (trinn 7) for å generere nye keratinocytter i dermal-spesifikke tap-eller gevinst-of- funksjon studier.
Dette kammeret hår analysen produserer hårsekken tetthet og kvalitet som ligner vanlig mus huden, selv om hårvekst er noe mindre synkronisert og hårsekken orientering er mer tilfeldig. Noen begrensninger i håret gjenfødelse genetisk analyse inklue kravet av store mengder lentivirus og antall celler, og det er svært arbeidsintensiv i form av kirurgiske metoder når sammenlignet med andre former for hår blandingsprosedyrer assays som plasteret og klaff analysene 3,4,14. Imidlertid er kvaliteten på hårsekkene og tidslinje for å oppdage hårvekst overlegen andre analyser 4. Vår målrettet hår regenerasjon analysen gir en rask og praktisk følgesvenn til eksisterende genetiske modeller.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) og NIH tilskudd AR052785 og AR046786 (AEO og W.-MW).
Name | Company | Catalog # | Comments |
PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
Dispase | Roche | 4942078001 | |
Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |