Summary
Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Nöral plaka ön bölgede gözdeki doğurur hangi süreci klinik ve temel hem de araştırma önemli bir odak noktası olmaya devam ediyor. Retina hastalığı anlaşılması ve tedavi edilmesi için, bariz bir tıbbi uygunluk ilave olarak, omurgalı retina gelişimi nöronal hücre tipi anlaşılmasını kararlılık ve farklılaşması için 1-16 ve önemli bir şık model sistemi olarak hizmet etmektedir. Nöral retinada basmakalıp katmanlar halinde düzenlenmiş altı ayrı hücre tipleri (gangliyon, yatay, amacrine fotoreseptör, bipolar hücreleri ve Müller glial hücreler), büyük ölçüde tüm omurgalıların 12,14-18 arasında korunduğunu bir deseni oluşur.
Sağlam gelişen embriyo retina okuyan açıkça bu kompleks organ katmanlı bir yapıya önbeyin bir çıkıntı gelişir nasıl anlaşılması için gerekli iken, fro yararlanacak pek çok soru varm varsayımsal retina hücrelerinin primer hücre kültürü 7,19-23 kullanarak yaklaşımlarının uygulanması. Örneğin, farklı aşamalarında kaldırılır ve ayrışmış dokulardan hücrelerin analiz biri farklı gelişim aşamalarında tek tek hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi durumu ayırt etmek için izin verir, bu ise, komşu dokulara 8,19-22 ile etkileşimi yokluğunda hücrelerin kaderini ,24-33. Primer hücre kültürü de araştırmacının belirli reaktifleri ile kültür tedavi ve tek hücre düzeyinde 5,8,21,24,27-30,33-39 üzerindeki sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Xenopus laevis, çalışma için klasik bir model sistem erken nöral gelişim 19,27,29,31-32,40-42, retina birincil hücre kültürü 10,38,43-45 için özellikle uygun bir sistem olarak hizmet vermektedir.
Presumptive retina dokusunun hemen nöral indüksiyon 25,38,43 takiben, gelişiminin erken aşamalarında erişilebilir. Buna ek olarak, inci verilmişembriyo her hücre sarısı bir kaynağı da içerir, retina hücreleri tamponlanmış bir tuz çözeltisi, çok basit bir tanımlandığı ortamda kültüre edilebilir, böylece kuluçka veya diğer serum bazlı ürünlerin 10,24,44-45 şaşırtıcı etkileri kaldırma .
Bununla birlikte, çevre dokular ve daha sonraki işleme retina dokusunun izolasyon zordur. Burada da, tek bir hücre çözünürlükte kalsiyum etkinlik ve gen ekspresyonu için analiz edilecek birincil hücre kültürleri hazırlamak için kullanılır Xenopus laevis retina hücreleri disseksiyon ve ayrılma için bir yöntem sunmaktır. Bu yazıda sunulan konuyu kendiliğinden kalsiyum Transientlerin analiz ederken, teknik araştırma soruları ve yaklaşımlar (Şekil 1), geniş bir dizi geniş uygulanabilir.
Protocol
Tüm deneyler William and Mary College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip yapılmaktadır. Bu protokolde atıfta Gelişim aşamaları Nieuwkoop ve Faber 46 göredir.
1. Teşrih
- Hücre Kültürü Orta ve oda sıcaklığına gelmesini Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) izin verin. Ayrıca 0,1 X Marc Modifiye Ringer (MMR) pH 7.4-7.6 gerekir.
- Bir hücre kültür laminer akış başlık içinde 30 dakika süre ile bir UV ışını uygulanarak aşağıdaki öğeleri sterilize edin. (Davlumbaz yerleştirmeden önce% 70 etanol ile her öğenin püskürtün.)
- 35 mm plastik Petri kapları.
- 60 mm plastik Petri kapları.
- 35 mm Nunclon yüzey yemekleri.
- 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri.
- P1000 mikropipet (1.000 ul mikropipet).
- Aerosol dayanıklı P1000 ipuçları (1.000 ul mikropipet Aerosol dayanıklı ipuçları).
- Alkoldayanıklı kalem.
- Forseps diseksiyon Güzel.
- * 15 ml konik boru (sadece görüntüleme kalsiyum etkinlik için).
- * Sadece kalsiyum aktivite görüntüleme için.
- Kaput UV sterilize ve çözümleri oda sıcaklığına sahip edildikten sonra, kaputun% 70 etanol ve yerde medya şişeleri ile eldiven ve medya şişeleri yıkadığınız, kaputu laminer hava akışı açın.
- Kaput içinde uygun etiketleme sağlanması, hücrelerin her bir plaka için P1000 mikropipet ile aşağıdaki hazırlamak.
- Diseksiyon Levha - Bir 60 mm plastik Petri kabı 10 ml Hücre Kültürü Orta içeren.
- Kültür Levha - Bir 35 mm Nunclon yüzey çanak 2 ml Hücre Kültürü Orta içeren. (Nunclon plastik tabaklar başka herhangi bir yapıştırıcı ile tedavi edilmez.)
- Bir boş 1,5 ml mikrosantrifüj tüp-Eksplantasyon Ayrışma Tüp.
- * Bir adet 15 ml konik şahintüp 15 ml Hücre Kültürü Orta içeren. Aşırı Fluo4-AM görüntüleme kalsiyum aktivitesi zaman dışarı yıkamak için.
- Kaput içinde, her diseksiyonu oturum için P1000 mikropipet (birden fazla retinada tek oturumda disseke edilebilir) ile aşağıdaki hazırlamak.
- 2 ml CMF içeren bir 35 mm plastik Petri kabı - Eksplantasyon Plaka durulayın.
- Eksplantasyon Disosiyasyon Levha - 2 ml CMF içeren bir 35 mm plastik Petri kabı.
- Kaput dışında aşağıdaki hazırlayın:
- 10 ml 0,1 X MMR içeren hücre plaka başına biri 60 mm plastik Petri kabı - Plaka Holding.
- 10 ml 0,1 X MMR içeren hücre plaka başına biri 60 mm plastik Petri kabı - Kardeş Plate.
- Anestezisi Levha - 10 ml 0,1 X MMR + 0.5 mg / ml MS-222 (tricaine) içeren diseksiyon seans başına bir 60 mm plastik Petri kabı.
- Aşamada 30 yaşından küçük bir embriyo diseksiyon varsa, Dissection Levha (bir 1 mg / ml kollajenaz B çözeltisi ile sonuçlanan), çözülür ve kenara girdap 10 mg Kollajenaz B ekleyin.
- Istenen aşamada bir embriyo seçin, steril olmayan bir transfer pipet ile Holding Tabak aktarmak ve ince forseps kullanarak vitellin membran (embriyo henüz yumurtadan değil ise) çıkartın.
- Transferi birkaç aynı steril olmayan bir transfer pipet ile Kardeş Plate embriyolar sahneledi.
- Embriyo 25 veya eski ise, steril olmayan bir transfer pipet ile anestezisi Plate embriyo transferi ve hareket ve uyaranlara yanıt durana kadar embriyo oturmasına izin aksi diseksiyon ile doğrudan devam. Bu sürebilirkadar bir dakika.
- Diseksiyon kapsamı (4X objektif, 10X oküler) altında diseksiyon (Şekil 2) ile devam edin.
Embriyo aşaması için 25 veya daha genç:
- Steril olmayan bir transfer pipet ile Diseksiyon Plate embriyo transfer.
- Ince forseps iki çift kullanarak, posterior ucundan başlayan ve embriyo ön kısmında çimento bezi mecraını, embriyonun ventral tarafında bir midsagittal kesim yapmak.
- Kesme ya da kenarından tutup sağ ve sol yayarak embriyo dikkatlice açın. Diseksiyon Tabak içine bakan sırt tarafında bir embriyo ve ventral ektoderm ile bu sonuçlar içinde endoderm ve mezoderm ortaya çıkarmak için açık yayıldı.
- Endoderm ve mezoderm (Şekil 2A ve 2B) kaldırarak başlayın. Bu doku ilk ve en büyük tabaka ile görünüş olarak çok "kabarık" olduğubüyük hücreler ve az belirgin organizasyonu.
- Bu katman çıkardıktan sonra, Somitlerin ve Notokordun görünür hale gelecektir. Daha iyi kontrast için, 10 ml Hücre Kültürü Orta ve Diseksiyon Plaka geri aktarmadan önce 2-3 dakika süreyle Nil Mavi Sülfat 1% çözelti 100 ul (suda) içeren ayrı bir 60 mm plastik Petri kabı embriyo taşıyın. Bu kolay tanımlama ve yönlendirme için ektoderm, Somitlerin ve Notokordun leke olacaktır.
- Embriyonun ön kısmı üzerinde yoğunlaşırken, dikkatle Notokordun ve beyin ve optik veziküller (Şekil 2C) maruz kalan mezoderm çıkarın.
- Beyin ve optik veziküller tamamen maruz sonra, beynin sadece posterior nöral tüp ve altta yatan ektoderm sever forseps kullanın.
- Ektoderm üstüne o kadar fazla bu kısmı (beyin ve optik veziküller) çevirin.
- Dikkatli, temel optik veziküller zarar vermemeye özen yeniden alınması(Şekil 2B) ektoderm taşıyın.
- Nihayet, forseps kullanarak, beyin (Şekil 2D ve 2E) gelen optik veziküller ayırın.
: Sahne 25 fazla embriyo yaşlı için
- Embriyo anestezisi Levha iken, forseps ile embriyonun ventral kısmı çıkarın.
- Daha iyi kontrast için, 10 ml 0,1 X MMR ve Diseksiyon Plaka aktarmadan önce 2-3 dakika süreyle% 1 Nile Blue Sülfat 100 ul içeren bir 60 mm plastik Petri kabı embriyo taşıyın. Bu ektoderm mavi leke olacaktır.
- Bir kez Diseksiyon Plate, retina (veya embriyo aşaması 26-30 için optik vezikül) (Şekil 2F ve 2G) örten ektoderm geri çekin. Nile Blue Sülfat kullanılmışsa, ektoderm mavi lekeli ama altında yatan retina dokusunun olmaz edilecektir.
- Fo ile dikkatlice retina veya optik vezikül kaldırrceps (Şekil 2H, 2I ve 2J). Bu forseps bir çift ile yerine embriyo tutun ve retina veya diğer optik vezikül kaldırmak için yardımcı olur.
2. Doku ve Hücre Kaplama Ayrışma
Önemli Not - dokuları aktarırken, retina veya optik vezikül herhangi bir hava-sıvı sınırları temas etmesine izin vermez; bu oluşursa olmuş akyuvarlar olacaktır.
- Optik vezikül veya retina diseke edildikten sonra, dikkatle Aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak p100 mikropipet ile Tabak durulayın ve 30 sn için oturup izin Eksplantasyon aktarmak.
- Eksplantasyon Disosiyasyon Tube Eksplantasyon Ayrılma Levhadan CMF% 0.1 tripsin 80 ul aktarın.
- Bir p100 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak, Eksplantasyon gelen retina veya optik vezikül aktarmak Eksplantasyon Dissociati için Plaka durulayınTube, eksplant transferi kaçınarak çözüm durulayın.
- Doku, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Eksplant ayrışma Tüp içinde ayrıştırmak için izin verin. Bir retina plaka başına kullanıldı, ancak bunun çok plaka başına hücrelerin sayısını arttırmak için arzu edilirse, birden fazla levha başına kullanmak mümkün olduğunu not edin.
- Plaka hücreleri için, önce yavaş yavaş Eksplantasyon Ayrılma tüp solüsyon 40 ul kaldırmak ve p100 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak atın. Bir p100 set 40 ul ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak, Kültür Plate hücreleri (şimdi doku ayrışmış olduğunu) aktarın. Plaka üzerine hücreleri aspire zaman, yavaş yavaş, pipet ve plaka merkezinde, küçük bir alanda hücreler tutun.
Not: hücrelerinin birden fazla görüntü deney boyunca alınacak ise, Kültür Plate alt etmek için bir ızgara (Cellattice) ekleyin
- Hücreler Nunclon plaka uymak için en az 1 saat süreyle rahatsız edilmeden bekletin. Bu süreden sonra, onlar çok nazikçe tedavi edilmelidir veya müstakil hale gelebilir.
- Hücreleri gibi, aynı sıcaklıkta yetiştirilir kardeş embriyolar izlenerek istenen aşamada Kültür hücreleri. Canlı hücreler ileri işleme için kullanılan değilseniz, onlar şu anda MEMFA solüsyonu ile tesbit edilebilir.
Önemli Not: Bizim deneylerin çoğu hücreleri kaplama 6 saat içinde sabittir. Kültür hücrelerin ömrü doku ayrılmakta aşamayı ve hücreler hala mevcut olan yumurta sarısı miktarına bağlıdır; hücrelerinden elde ederken küçük (neurula aşamaları) dan parçalanmış hücreler 5-6 gün boyunca kültür içinde sağlıklı kalır Büyük embriyolar (iribaş yüzme) aşamaları 2-3 gün kültüründe canlı kalacaktır.
3. Kalsiyum Görüntüleme 47-49
Bu protokol kalsiyum duyarlı bireysel hücrelerin kalsiyum geçici ölçmek Fluo4-AM ve konfokal mikroskopi kullanır. Fluo4-AM kullanan tüm adımlar Fluo4-AM, ışığa duyarlı olduğu için, ışıktan uzakta yapılmalıdır. Tüm yıkar eklenen veya P1000 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak çıkarılmalıdır. Pipetleme yavaş yavaş ve hücreler rahatsız etmemek için levha kenarına doğru yapılması gerekir. Kültürler genellikle disseke 6 saat içinde sabit olduğundan Medya değiştirilmez. Daha uzun süreli kültürler için, her gün ortam değiştirilmesi gerekir.
- Fluo4-AM -20 ° C'de saklanır ve biz 5 ul alikotları saklamak öneririz. Kullanmadan önce, ışıktan uzak Fluo4-AM bir 5 ul kısım Çözülme ve doğrudan bu kısım için Pluronic F-127 2 ul ekleyin.
- Zaman, istenen miktarda için kültür sonrası hücreler (en azından1 saat), kültür plakasına hücre kültürü aracı maddesi 1 ml çıkarın. Nazik pipetleme tarafından karıştırılması, Fluo4-AM ve Pluronic Bu ekle.
- Yavaş yavaş görüntülenmek üzere hücrelerin kültür plakasının kenar geri Bu çözeltinin her aktarmak ve Fluo4-AM, emme ile 1 saat boyunca rahatsız edilmeden bu çözelti içinde hücreler bırakın.
- Yıkamak için hücre kültür ortamından Fluo4-AM fazlalığı, aşağıdaki yıkama serisi tamamlayın:
- Plaka ortam 1 ml çıkarın.
- Plaka taze hücre kültür ortamı, 3 ml (15 ml konik borudan) ekleyin.
- İki ek yıkama sıvıları, her zaman yavaş yavaş plaka çözeltisi, 3 ml taze çıkarılması ve hücre kültür ortamı, 3 ml ekleme yapın.
- Hücreler hemen hücre kültür aracı maddesi içinde 4 ml olmak ve Fluo4-AM içermelidir. Fluo4-AM, enzimatik olarak hücre difüzyon üzerinden ya da herhangi bir membrana bağlı bölme içine önlenmesi, hücre içinde bir kere kesildi. Kültür karışmasını işaretleyici partikülleri önlemek için kapağı tutarken görüntüleme için konfokal mikroskop sahneye plaka yüklemeden önce, yemeğin üzerine kalıcı bir kalem ile bir kırmızı dikey çizgi çizin. Dikey çizgi Petri kabı (Petri kabı değil, kapağın taban) bir tarafı aşağı çekilir. Bunun amacı, tek tek hücrelerin kesin oryantasyon ve hizalama sonraki bir noktada yeniden oluşturulmasını sağlar, öyle ki, görüş alanı ile ilgili olarak kültür plakasının yönünü göstermek içindir.
- Plaka hemen görüntüleme için eş odaklı mikroskop aşamasında üzerine yüklenmesi için hazır hale gelir. Konfokal mikroskop (objektif 20X) tarama bir lazer üzerinde parlak bir alan ayarları kullanarak hücrelerin gözünüzde canlandırın. Daha sonra daha kolay görüş aynı alanda bulma yapmak Cellatice lamel büyük ızgara numaralarını içeren bir görüş alanı ile, tercihen kümeleri içermiyor yoğun hücrelerin bir alan bulun yaparken si sonra görüntüleme kültürütu hibridizasyon. Görüntüleme öncesinde, kültür aracılığıyla aşağı odaklanmak ve hücre kültürü yerini ve yönünü kaydetmek için hücrelerin altındaki grid parlak bir alan görüntü çekmek. Bu, daha sonraki analiz için hücrelerin yeniden düzenlenmesi için olanak sağlar.
- Odak düzlemi kaldırın ve başlangıç kalsiyum görüntüleme (Şekil 3A) öncesinde hücrelerin parlak bir alan görüntü yakalayabilir.
- Hücrelerin orta odak düzleminde sonra, plaka kalsiyum etkinlik görüntülenmesi için hazır hale gelir. Ayarlar mikroskop ve uygulamaya bağlı olarak değişecektir. Bu görüntü, aşağıdaki parametreler ile, 1, 2, ya da 12 saat boyunca bir argon 488 nm lazer kullanarak hücreleri:
- 1 saat görüntüler:
- Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 4 tarar.
- Her 4 sn (saat başına 900 taramalar) kez tarayın.
- 2 saat görüntüler:
- Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 4 tarar.
- Her kez tarayın8 sn (saat başına 450 taramalar).
- 12 saat görüntüler:
- Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 2 tarar.
- Her 48 sn (saat başına 75 taramalar) kez tarayın.
- 1 saat görüntüler:
Bu parametreler, her bir zaman dilimi için 900 hareketsiz çerçeve görüntüleri bir dizi neden olur. Kalsiyum aktivite sonra bu ImageJ 50 gibi bir görüntü işleme uygulaması kullanımı ile zaman ders görüntüleri (Şekil 3B) üzerinde floresans düzeyleri analiz tarafından kaydedilebilir.
4. Hücreleri Tespit
- Görüntüleme takiben, hücreler plaka çözelti 3 ml kaldırma ve kültür ortamının kalan 1 ml 1 ml 2X MEMFA ekleyerek 30 dakika boyunca sabit olabilir.
- Tespit edildikten sonra, MEMFA kaldırmak ve 5 dk yıkama, her biri 1 ml'lik bir hacim, bir dizi olan hücreler kurutmak:
- 1X fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde% 25 etanol.
- 1X PBS içinde% 50 etanol. <sdd H 2 O (steril deiyonize saf su) li>% 75 etanol.
- -20 ° C'de 1 ml% 100 etanol ve plaka deposu ile son yıkama yerine
Not: Metanol ayrıca, bu yıkama için ve depolama için de kullanılabilir.
5. Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)
Anderson Lab 52 tarafından özetlendiği gibi hücre kültürü için modifikasyonlar ile 51 tarif Kültürleri Xenopus için standart FISH protokolü kullanılarak test edilebilir. Anderson Lab protokolü Değişiklikler aşağıda listelenmiştir. Aksi belirtilmediği sürece tüm yıkar, yaklaşık 1 ml hacminde 35 mm Nunclon plakalar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Solutions olarak Sive et al tanımlandığı gibidir. 53 aksi belirtilmediği sürece.
Önemli Not: için görüntülü hücreleri üzerinde in situ hibridizasyon yaparken floresein etiketli RNA problar kullanmayınkalsiyum aktivite. Anti-floresein antikorları rezidüel hücreleri Fluo4-AM ve kültürün tüm hücrelerde pozitif sinyal neden olabilir bağlanacaktır.
1. Gün: permeabilization ve Hibritleşme
- Rehidrasyon yıkama depolama için kullanılan susuz çözücü ile derecelendirildi olmalıdır. Bizim deneyler için, yıkar 1X PBS içinde etanol kadar derecelendirildi.
- Rehidrasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika için her bir 1X PBS içinde hücreler üç ilave kez yıkayın.
- Falcon bir tüp içinde asetik anhidrit ile 62.5 ul 0.1 M trietanolamin (pH 8.0), 25 ml iyice karıştırılır ve Anderson, Lab 52 protokolü olarak ele dağılana kadar hızlı bir şekilde karıştırılır. Oda sıcaklığında 10 dakika için bu karışım içinde kültür inkübe edin. Asetik anhidrid tedaviden sonra, oda sıcaklığında 5 dakika için 1X tuzlu sodyum sitrat (SSC) içinde hücreleri yıkayın.
- Son SSC yıkama çıkarın ve hücrelerin geçirgenliği 10 dakika için 0.2 M HCl (sdd H 2 O) ile değiştirin. </ Li>
- 5 dk için 1X PBS içinde iki yıkar ile HCl yıkayın.
- 6 saat 60 ° arasında, en az bir çalkalamalı su banyosu içinde C'de ISH tampon içinde Prehybridize, ancak bu ciddi bir şekilde işaret azaldıkça bir gecede prehybridize değildir.
- Seyreltilmiş prob 750 ul (saflaştırılmış probundan 1:250 dilüsyon) 8-14 saat boyunca 60 ° C sıcaklıkta gecede melezleşme. 1.0-1.5 gelen prob konsantrasyon aralıkları saflaştırılmış mikrogram / ul.
2. Gün: İlişkisiz Probe ve Antikor Kuluçka giderimi
- Sonda çıkarın ve 60 0,2 X SSC içinde 5 dakika için kültür durulama ° C. 60 ° C'de 1 saat boyunca taze 0,2 X SSC içinde yıkayın
- Su banyosundan kültürleri çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin verir.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 0,2 X SSC ile yıkayınız.
- % 0.1 Triton-X-100 (PBT) ile 1X PBS içinde 15 dakika süreyle yıkanır.
- Endojen peroksidaz inaktive için, PBT% 2 H 2 O 2 çözelti içinde 1 saat süreyle yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Maleik asit tampon (MAB) içinde% 2 engelleme Reaktif olarak engelleme. Bu engelleme yönteminde, PBT% 20 koyun serum içinde bloke önceki yöntemlere göre hassasiyeti artar olduğunu bulduk.
- 4 ° C'de gece boyunca bir POD-konjuge antikoru içeren bir 1:1,000 seyreltme MAB içinde% 2 engelleme Reaktif 1 ml kültürler inkübe
3. Gün: İlişkisiz Antikor çıkarılması ve Floresans Geliştirme
- Antikor çözeltisi çıkarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için TBST içinde 3 kez yıkayın.
- Sürekli olarak yavaş bir hızda sallanan ise, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle TBST içinde 4 kez yıkayın.
- 10 dk için oda sıcaklığında PBT içinde iki kere yıkayın.
- PBT içinde seyreltilmiş 1:200 floresein-tyramide veya 01:25 Cy3 tyramide 750 ul uygulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edin ve 2.5 ul% 0,3 'H 2 eklemek 2. Sinyal geliştirmeye olanak 40 dk için sallayın.
- Sallama ile oda sıcaklığında TBST içinde 15 dakika her biri için en az 4 kez yıkayın.
- Sinyal tam gelişmiş bir kez, 1X PBT 5 dakika yıkayın.
- 4 ° C'de 1 saat oda sıcaklığında ve 1X PBS içinde depolamak için 1X MEMFA olarak saptamak
6. Görüntü BALIK Sonuçlar ve Co-kayıt Kalsiyum Görüntüleme Veriler
- BALIK tamamlanmasından sonra, hücre kültür plakaları hangi hücrelerin belirli bir prob için pozitif bir floresan sinyalinin gösterime belirlemek için görüntülü. Kalsiyum görüntüleme sırasında çalışılan görüş kesin bir görüş alanı bulmak ve kalsiyum görüntü kareleri yönüne plaka hizalamak için Cellattice lamel kullanın.
- Hücrelerin merkezinde düzlemine Odak ve maksimum 1 mW güç (Şekil 3C) 15% az Helyum-Neon HeNe 543 nm lazer kullanarak tek bir yüksek çözünürlüklü görüntü almak.
- Kalsiyum Görüntüleme protokolü alınan görüntülerin belirlenen orijinal 900 çerçevesinde,bir görüntü işleme programı (örneğin ImageJ 50 gibi) kullanımı yoluyla ilgi bölgeleri olarak tek tek hücrelerin (ROI) belirlemek. Zaman floresans çifti değerleri (Şekil 4) temsil eden veri noktaları kümesi olarak ROI floresans verileri ayıklayın.
- Kalsiyum görüntüleri (Şekil 3D) tespit ROI'ler ile FISH sonuçlarına görüntü bindirmesi.
- Prob için negatif, prob için pozitif ya da bilinmeyen bir şekilde her bir ilgi kayıt - YG karşılık gelen hücre artık FISH görüntünün görüş alanı içinde bulunabilir olması durumunda.
- Farklı disseke aşamaları (Şekil 5A ve 5C) veya farklı FISH probları (Şekil 5B ve 5D) için pozitif hücreler arasındaki kalsiyum aktivite seviyelerini karşılaştırmak için istatistiksel analiz komut (olarak MATLAB veya başka programlama dili ile tasarlanmış) kullanarak Süreci ROI floresans verileri. Bizim Laboratuarda kullanılan bütün betikler istek üzerine serbestçe kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir şekilde parçalanmış, optik vezikülleri (aşama 25) ve retinae (aşama 35) örnekleri Şekiller 2E ve 2J gösterilmiştir. Bu protokol geliştirme çeşitli aşamalarında kullanılabilir olsa da, daha fazla deneyler için doğruluğunu sağlamak için sadece retina dokusunun elde etmek önemlidir. Dikkatle tüm aşamalarında epidermisin kaldırmak ve forseps retina dokusunun ponksiyon olmamasını sağlamak. Aşama 35 veya daha büyük ise, mercek retina üzerinde bir katman açık olarak görülebilir ve forseps kullanılarak dikkatli bir kazıma ile çıkarılabilir.
Başarılı bir kaplama primer hücre kültürü Şekil 3A'da gösterilmiştir. Doku dissociating zaman, durulama çözeltisi içinde dissociating gelen doku engellemek için önerilen 30 saniye inkübasyon süresinden daha uzun bir süre boyunca durulama çözeltisi içinde retina eksplant bırakmak için önemli değildir. Buna ek olarak, doku tam bir saat için tripsin çözelti içinde ayrıştırmak için izin verilen sağlamakKültür plaka hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için (eski embriyonik ve larva dönemleri daha uzun gerekebilir). Hücreler kaplanmıştır kez plaka hareketli ve plaka hücreleri yıkama önlemek için çözümler değiştirirken, dikkatli olun.
Şekil 3B ve 3C sırasıyla kalsiyum aktivite tarama ve in situ hibridizasyon deneyleri (FISH) floresan görüntüleri göstermek. Kalsiyum görüntü içinde parlak yeşil görünen Hücre içi kalsiyum depolarının serbest bir sonucu olarak hücre içi kalsiyum seviyelerinde bir geçici başak gören hücrelerdir. Hücreler daha sonra BALIK kullanılarak gen ekspresyonu için tahlil edilebilir ve gen ekspresyonu görüntüleri (Şekil 3B) overlaying tarafından kalsiyum spiking aktivite desenleri ile korele edilebilir. Python ve MATLAB kodları (istek üzerine serbestçe kullanılabilir) bir arada kullanarak, verileri her individu floresans aktivitesi analiz ederek elde edilirgörüntüleme ders alarak ilgi arkadaşları bölgesi (ROI). Görüntüleme 1 saat içinde bir tek hücre (ROI) için kalsiyum etkinlik bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir, bir başak görüntüleme yaklaşık 57 dak görülebilir. Tablo 1, çeşitli problar için pozitif hücrelerin yüzdesi için temsilci veriler gösterilir; literatürde bu deney (mevcut deneyler nokta, bu yüzdesini tespit etmek) için özel herhangi bir veri bulunmamaktadır iken, bu bulguların ile tutarlıdır omurilik 17,55,56 kalsiyum aktiviteye ilişkin deneyler benzer tipte verileri.
Analiz için kullanılan parametreler sayısı, frekans ve başak genliği vardır. Şekil 5 xVglut1, Ptf1a ve xGAD67 için problar kullanılarak embriyonik retina hücrelerindeki kalsiyum görüntüleme ve FISH deney temsilcisi sonuçlar sağlar. MATLAB kodları, EAC için başak sayısı Kullanmah ROI tespit edilir ve başak sayısı deneydeki tüm kontrol bölgeleri için ortalaması alınmıştır. Her deneyden başak ortalama sayısı daha sonra deney grubu için ortalama sonuçlanan, diğer deneyler ile derlenebilir. Kümülatif dağılım araziler bir grup dahilindeki tüm deneyler için başak ortalama sayısı dağılımını görüntülemek için oluşturulabilir. MATLAB komut ardından verilerin istatistiksel analizi için kullanılır.
Şekil 5 MATLAB analizi takiben temsilcisi verileri gösterir. Kısaca, bizim sonuçlarımız spiking aşamada 35 peaking ile, kalsiyum aktivite gelişimsel düzenlenir olduğunu göstermektedir (p <0.002) (Şekil 5A ve 5C). Istatistiksel olarak anlamlı farklılık vardı, belirli bir prob için pozitif hücreler ile kalsiyum aktivitesi korele açısından Ancak highe görüntülemek için xGAD67 (farklılaşmış GABAerjik hücreleri için bir marker) için pozitif hücreler için bir eğilim (p = 0.08) vardı Bir glutamaterjik işaretleyici veya Ptf1a, GABAeric fenotipi teşvik ile korele bir transkripsiyon faktörü geni şifreleyen bir gen için pozitif hücreler daha kalsiyum spiking aktivite r seviyeleri. Ön olsa da, bu veri Ptf1a düzeyinde hareket etmeyecektir Ptf1a bağımsız bir şekilde bir veya aktivite bağımlı nörotransmiter şartname içinde gelişir, GABAerjik hücreleri, söz konusu olabileceğini düşündürmektedir.
Şekil 1. Usul şematik. Sonra retina dokusunun parçalanmıştır ve ayrışmış, birincil hücre kültürü geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir.
s.jpg "/>
Şekil 2. Diseksiyon fotoğraflar. Embriyolar artmış kontrast Nile Blue Sülfat boyandı. AE: Sahne 24. FJ: Sahne 35. Kısaltmalar:. Ov, optik vezikül, fb, önbeyin; sc, spinal kord, bana, mezoderm, böylece, Somitlerin; le, lens; cg, çimento bezi; re, retina, ep, epitel büyük bir rakam için tıklayınız .
Şekil 3,. ROI'ler ile hücre kültürü Görüntüleri. A. çember Aydınlık alan. ROI'ler ile Fluo-4 (AM) tedavisini takiben B. Görüntü çember. C. FISH görüntü (oklar voltaj kapılı kalsiyum kanal CaV2.1 arasında alfa alt birimi için pozitif hücrelerin örnekleri göstermektedir). D. parlak alan Yerleşimi, Fluo-4 ve FISH görüntüler.
7/4377fig4.jpg "alt =" Şekil 4 "fo: content-width =" 3.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Şekil 4. Tek bir hücre (ROI) için kalsiyum aktivite örneği. Bir Fluo4 kalsiyum floresan görüntü floresans (bağıl floresans birimlerinde, RFU) vs süresi (dakika olarak) Arsa.
Şekil 5,. Sonuçlar sahne ve sonda ile kalsiyum çivileme görüntüleniyor. A. 30 aşamasında kalsiyum başak ortalama sayısı (n = 4), 35 (n = 8), ve 38 (n = 13). Aşamada 35 xVglut1 (n = 3) in situ hibridizasyon için kullanılan farklı problar arasında kültür başına kalsiyum başak B. ortalama sayısı, xGAD67 (n = 3) ve Ptf1a (n = 4). Aşamaları 30, 35, 38 kültür başına başak ortalama sayısı C. Kümülatif dağılım arsa. D. Kümülatif distributi. Pozitif aşamada 35 in situ hibridizasyon probları için sinyal sahip olarak tanımlanan hücrelerin kültür başına başak ortalama sayısı arsa üzerinde; xVglut1, xGAD67 ve Ptf1a büyük bir rakam için tıklayınız .
| Sonda | Sahne | n (plakalar) | n (hücreler) | Pozitif Yüzde |
| xGAD67 | 35 | 4 | 1042 | % 2 |
| 38 | 4 | 690 | % 2 | |
| Ptf1a | 30 | 3 | 352 | % 1 |
| 35 | 6 | 1856 | % 1 | |
| xVglut1 | 30 | 1 | 47 | 57% |
| 35 | 3 | 692 | % 2 | |
| 38 | 3 | 364 | 4% | |
Tablo 1. Yüzde pozitif hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm omurgalılar arasında muhafaza edilir, iyi karakterize hücre tipleri ile, retinanın hücre tipi özellikleri ve farklılaşma yöneten molekül hücresel süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlamaktadır. Birincil hücre kültürü ve gen ekspresyonu, protein dinamiği, ve kalsiyum ve tek bir hücre çözünürlük düzeyde elektrik etkinlik içeren işlemler çok çeşitli araştırma için güçlü bir yöntem tanıyor. Burada varsayımsal Retina gelişimi ve primer hücre kültürü çok erken aşamalarında kolayca ulaşılabilir olduğunu Xenopus laevis, verilen bu tür çalışmalar için özellikle uygundurlar organizmada disseke varsayımsal retina dokusunun primer hücre kültürü için basit bir tekniği sunmak bir oluşabilir Basit bir salin çözeltisi, tanımlanmış ortam.
Çoğu laboratuvar ortamlarında kolayca adapte olmasına rağmen, özellikle yakın ilgi gerektiren birkaç adım vardır. Dissections taze bilenmiş forseps ile yapılmalıdır. Hücre kültür aracı maddesi ile karıştırılmış collagenase B ile muamele dan daha küçük olan aşamalar (<st. 30) faydalanır. Başka bir doku ya da bir medya bir hücre transferi kapsayan tüm adımlar hava arayüzünün yakınında çözelti haline gelen gelen doku ya da hücre önlenmesi için özel dikkat ile yapılmalıdır. Doku ihtiva pipet tamamen sıvı, bol batırıldıktan ve hücreler ya da doku çok yavaş bir şekilde dışarıya çıkmalıdır. Hücreler kaplama edildikten sonra, Fluo4-AM Buna ek olarak, ve hücre kültür aracı maddesi, ya da tespit yıkama dahil olmak üzere, tüm sıvı transferi, dikkatlice hücreler kolaylıkla uzaklaştırılabilir göz önüne alındığında, gerçekleştirilmelidir. Tüm hücre kültürü olduğu gibi, sterilite sorundur, bu nedenle bakım tüm malzemeleri sterilize etmek için alınmalıdır. Nihayet, disosiye retina eksplantlar ayrışma ortamda belirlenen süre için oturup icar başarılı hücre bağlanma için kritik olan ve kümelenmeyi önlemek.
Sırasındabu protokolü açıklanan diseksiyon ve kültür durumu, nekroz ve apoptoz hem (daha az hücrelerin% 5-10 daha az) son derece sınırlı. Plaka üzerinde hücre kaybı (apoptoz) nadiren öncesi ve sonrası konfokal görüntüleme oturumları sırasında fark edilir. Dikkatle hücre kültürleri Handling hücre canlılığı anahtarıdır. Çözüm değişiklikler hücre nekrozu ve apoptoz engelleyecek çok yavaş ve istikrarlı bir şekilde yapılmalıdır. Retina hücre tiplerinin kesin oran tanımlamak için deneyler halen devam etmektedir, biz retina hücre tipleri çeşitli kültürler ve Muller glial hücreler (belirgin bir morfoloji var) temsil gibi görünüyor unutmayın kültürlerin hakim değil yapmak .
Situ hibridizasyon deneyleri sonra plakları analiz potansiyel bir endişe bazı hücreler taşınmış olabileceğini, ancak bu hücre izleme programlarının kullanımı ile ele alınabilir. Ayrıca, birincil hücre kültürü tekniği, yapısında önemli bir sınırlama thsağlam doku mevcut mekansal desenlendirme e açık bir kayıp. Bireysel hücre kimlik doku içinde pozisyon aracılığı ile, molekül yöntemleri kullanılarak yerine kurulmuş olması gerekir. Ancak, bu özellik ayrıca hücreleri çok hassas ve sürekli hücre-hücre etkileşimleri yokluğunda spesifikasyonu durumunu analiz için fırsat sağlar. Ayrıca, seçici olarak araştırmacı büyüme faktörleri ya da diğer bileşikler ile hücrelerin tedavisine izin veren ve hassas bir şekilde komşu hücreler gelen sinyallerin etkisi olmadan analiz eder. Bu retina diseksiyonu ve belirli nörotransmiter fenotipi belirteçleri ile kalsiyum görüntüleme ilişki için primer hücre kültürü tekniği istihdam ederken, bu tekniğin RT-PCR kullanılarak elektrofizyolojik kayıtların ve tek hücre gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere diğer downstream uygulamalar geniş bir yelpazede uyarlanabilir veya "yanında -gen "transcriptome analizi (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz nezaketle betikleri için Dr John Hayes ederim; Dr. Eric Bradley ve konfokal mikroskopi için yardım Christopher Del Negro, Drew Hughes, proje geliştirme ve ön veriler sağlayan çalışmaları için Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, ve Liz MacMurray; istatistiksel analize yararlı önerileri için Dr Greg Smith. Bu çalışma MSS bir NIH hibe (NINDS IR15N5067566-01) ve William and Mary College Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fen Bilgisi Eğitimi Hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||||||
| For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
| BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
| Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
| 35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
| Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
| Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
| Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
| Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
| Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
| Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
| Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
| 500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
| For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
| Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
| Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
| LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
| For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
| Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
| Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
| NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
| Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
| Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
||||||||||||||||||||||||
Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |
||||||||||||||||||||||||
References
- Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
- Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
- Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
- Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
- Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
- Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
- Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
- Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
- Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
- Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110 (2007).
- Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
- Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
- Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
- Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
- Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
- Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
- Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
- Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
- Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940 (2004).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
- Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
- Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
- Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
- Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
- Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
- Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
- Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
- Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
- Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
- Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
- Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
- Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
- Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
- Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11 (2008).
- Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
- In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
- Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
- Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259 (2011).
