Dissection, Cultuur en Analyse van<em> Xenopus laevis</em> Embryonale netvliesweefsel

Summary

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Abstract

Het proces waarbij het front van de neurale plaat leidt tot het vertebrate retina blijft een belangrijke focus van zowel klinisch en fundamenteel onderzoek. Naast de duidelijke medische belang voor het begrijpen en behandelen van retinale ziekte, de ontwikkeling van de vertebrate retina nog steeds als een belangrijk en elegant model voor begrip neuronale celtypen bepaling en differentiatie ^1-16. De neurale retina bestaat uit zes discrete celtypes (ganglion, amacrine, horizontaal, fotoreceptoren, bipolaire cellen en gliacellen Müller) aangebracht in stereotype lagen, een patroon dat grotendeels geconserveerd onder alle gewervelde dieren ^12,14-18.

Bij het bestuderen van het netvlies in het intacte ontwikkelende embryo is duidelijk nodig om te begrijpen hoe dit complexe orgaan ontwikkelt van een uitsteeksel van de voorhersenen in een gelaagde structuur, zijn er veel vragen die weer ten goede komenm dienst benaderingen met behulp van primaire celculturen van vermoedelijke retinale cellen ^7,19-23. Bijvoorbeeld analyseren cellen van weefsels verwijderd en gedissocieerd in verschillende stadia kan men de stand van specificatie van individuele cellen onderscheiden in verschillende ontwikkelingsstadia, namelijk het lot van de cellen in afwezigheid van interactie met naburige weefsels ^{8,19-22 ,24-33.} Primaire celkweek maakt ook de onderzoeker de cultuur behandelen met specifieke reagentia en de resultaten te analyseren op een enkele cel ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, een klassiek model voor de studie van vroege neurale ontwikkeling ^{19,27,29,31-32,40-42} dient als bijzonder geschikt voor retinale primaire celkweek ^10,38,43-45.

Vermoedelijke retinale weefsel is bereikbaar vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling, onmiddellijk na neurale inductie ^25,38,43. Daar bovendien thbij elke cel in het embryo een voorraad dooier bevat, retinale cellen kunnen worden gekweekt in een zeer eenvoudige gedefinieerde media bestaande uit een gebufferde zoutoplossing, waardoor de tot verstorende effecten van incubatie of andere sera gebaseerde producten ^10,24,44-45 .

Echter de isolatie van het retinale weefsel van de omringende weefsels en de daaropvolgende bewerking uitdaging. Hier geven we een werkwijze voor de ontleding en dissociatie van retinale cellen in Xenopus laevis die gebruikt worden om primaire celculturen die op hun beurt worden geanalyseerd op calcium activiteit en genexpressie op de resolutie van afzonderlijke cellen te bereiden. Terwijl het onderwerp in deze paper is de analyse van spontane calcium transiënten, de techniek is breed toepasbaar voor een breed scala aan onderzoeksvragen en-benaderingen (figuur 1).

Protocol

Alle experimenten worden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het College of William and Mary. Ontwikkelingsstadia waarnaar in dit protocol zijn volgens Nieuwkoop en Faber 46. 1. Ontleding Laat het celkweekmedium en Calcium Magnesium vrij medium (CMF) equilibreren tot kamertemperatuur. U zult ook moeten 0,1 x Marc's Gemodificeerd Ringer (MMR) pH 7,4-7,6. Steriliseer de volgende door een UV licht …

Representative Results

Voorbeelden van succes ontleed optische vesicles (fase 25) en retinae (trap 35) worden getoond in de figuren 2E en 2J. Hoewel dit protocol kunnen worden gebruikt in verschillende stadia van ontwikkeling, is het essentieel om alleen netvliesweefsel verkrijgen nauwkeurigheid voor verdere experimenten waarborgen. Verwijder voorzichtig de opperhuid in alle stadia en ervoor te zorgen dat uw tang niet doorboren de retinale weefsel. In fase 35 jaar of ouder, kan de lens worden beschouwd als een heldere laag bo…

Discussion

Met zijn goed gekarakteriseerd celtypen die geconserveerd zijn in alle vertebraten, de retina een nuttig model voor het bestuderen van de moleculaire cellulaire processen die celtype specificatie en differentiatie. Primaire celkweek biedt een krachtige methode voor het onderzoeken van een groot aantal processen waaronder genexpressie, eiwit dynamiek en calcium en elektrische activiteit op het niveau van enkele cel resolutie. Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor het primaire celkweek van ontleed vermoedelijke…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.