Disección, Cultura y Análisis de Xenopus laevis Tejido de la retina embrionaria

Summary

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Abstract

El proceso por el que la región anterior de la placa neural da lugar a la retina de vertebrados sigue siendo un foco importante de investigación tanto clínica como básica. Además de la evidente importancia médica para la comprensión y el tratamiento de enfermedades de la retina, el desarrollo de la retina de vertebrados continúa sirviendo como un importante sistema modelo y elegante para la comprensión neuronal determinación de tipo celular y la diferenciación ^1-16. La retina neural consta de seis tipos de células discretas (ganglio, fotorreceptores amacrinas, horizontal,, células bipolares, y las células gliales de Müller) dispuestas en capas estereotipadas, un patrón que es muy conservada entre todos los vertebrados ^12,14-18.

Si bien el estudio de la retina en el embrión en desarrollo está intacto claramente necesaria para la comprensión de cómo este órgano complejo se desarrolla a partir de una protuberancia del cerebro anterior en una estructura en capas, hay muchas preguntas que benefician from empleando métodos que utilizan cultivos celulares primarios de presuntas células de la retina ^7,19-23. Por ejemplo, el análisis de las células de los tejidos y se disocia en diferentes etapas permite discernir el estado de la especificación de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, es decir, el destino de las células en la ausencia de interacciones con los tejidos vecinos ^{8,19-22 ,24-33.} Cultivo de células primarias también permite al investigador para tratar el cultivo con reactivos específicos y analizar los resultados en un nivel de célula única ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, un sistema modelo para el estudio clásico de desarrollo neural temprano ^{19,27,29,31-32,40-42,} sirve como un sistema particularmente adecuado para el cultivo de células primarias de retina ^10,38,43-45.

Tejido de la retina presuntiva se puede acceder desde las primeras etapas de desarrollo, inmediatamente después de la inducción neural ^25,38,43. Además, dado then cada célula en el embrión contiene un suministro de yema de huevo, células de la retina pueden ser cultivadas en un medio de comunicación muy simples definidos que consisten en una solución salina tamponada, eliminando así los efectos de confusión de incubación o de otros sueros de los productos basados ​​en ^10,24,44-45 .

Sin embargo, el aislamiento del tejido de la retina de los tejidos circundantes y el posterior procesamiento es un reto. Aquí, se presenta un método para la disección y disociación de las células de la retina en Xenopus laevis que se usa para preparar cultivos de células primarias que, a su vez, se analizó la actividad de calcio y la expresión génica en la resolución de las células individuales. Si bien el tema presentado en este documento es el análisis de los transitorios de calcio espontáneos, la técnica es ampliamente aplicable a una amplia gama de temas de investigación y enfoques (Figura 1).

Protocol

Todos los experimentos se llevan a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Colegio de William y Mary. Etapas de desarrollo hace referencia en este protocolo son de acuerdo a Nieuwkoop y Faber ^46.

1. Disección

1. Permitir que el medio de cultivo celular y medio libre de calcio magnesio (CMF) se equilibre a temperatura ambiente. Usted también necesitará Modificado 0,1 X de Marc Ringer (MMR) pH 7.4-7.6.
2. Esterilizar los siguientes elementos mediante la aplicación de una luz UV durante 30 min en una campana de cultivo de células de flujo laminar. (Spray cad....

Results

Ejemplos de éxito disecados vesículas ópticas (etapa 25) y retinas (etapa 35) se muestran en las Figuras 2E y 2J. Aunque este protocolo se puede utilizar en varias etapas de desarrollo, es crítico para obtener sólo tejido de la retina para asegurar la precisión para experimentos adicionales. Retire con cuidado la epidermis en todo momento y asegurarse de que las pinzas no perforar el tejido de la retina. En la etapa 35 años o más, la lente puede ser visto como una capa transparente en la parte superior .......

Discussion

Con sus tipos celulares bien caracterizadas que se conservan en todos los vertebrados, la retina proporciona un modelo útil para el estudio de los procesos moleculares-celulares que regulan la especificación del tipo de célula y la diferenciación. Cultivo celular primario proporciona un método potente para la investigación de una gran variedad de procesos que incluyen la expresión génica, la dinámica de proteínas y el calcio y la actividad eléctrica en el nivel de resolución única célula. A continuación les presentamos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
			Para las disecciones y Cultivo
BD Falcon Easy Grip placas de cultivo tisular de 35 mm,	Pescador	08-772A
Platos desechables de poliestireno Petri, 60 x 15 mm	Pescador	0875713A
35 mm Nunclon superficie Petri Dishes (con Airvent)	Pescador	12-565-91
Dumont Fine Pinzas (Dumostar # 55)	Pescador	NC9341917
Cellattice Micro-dictaminó cubreobjetos de plástico, 25 mm	Pescador	50-313-17
Etil-m-aminobenzoato de metanosulfonato de sal (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Sulfato de Gentamicina	Enzo Ciencias de la Vida	380-003-G025
Gibco tripsina (1:250) en polvo	Life Technologies	27250-018
Colagenasa B de Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Nilo Azul Sulfato (opcional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml de vacío Filtro / almacenamiento de botellas del sistema, 0,22 micras de poro 33,2 cm 2 de membrana CN	Corning	430758
			Para obtener imágenes de calcio
Fluo-4 AM 1 mM en solución de DMSO, Cell Permanente	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% de solución en agua	Life Technologies	P-6866
LSM 510 sistema de microscopio confocal	Zeiss	Modelo Descatalogado
Reactivo bloqueador	Roche	11096176001
			Por hibridación fluorescente in situ (FISH)
Anti-digoxigenina-Pod, fragmentos Fab	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Anticuerpo	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3Éster de NHS	GE Healthcare	PA13101
NHS-fluoresceína	Thermo Scientific	46409
Formamida desionizada,	Amresco	0606-950ml
Torula ARN, Tipo IX	Sigma-Aldrich	R3629
Sal sódica de heparina, a partir de mucosa intestinal porcina	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Tabla 2. Reactivos y equipos específicos.
			Solución Referencia Contenido Medio de cultivo celular Chang y Spitzer, 2009 54 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicilina / Estreptomicina Ajustar el pH a 7,8 con HCl. Esterilizar por filtración mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras CN. Almacenar a 4 ° C. Calcio-Magnesio medio libre (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu y Spitzer, 1995 55 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicilina / Estreptomicina Ajustar el pH a 7,8 con HCl. Esterilizar por filtración mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras CN. Almacenar a 4 ° C. Tampón de ácido maleico (MAB) Sive y col., 2000 53 100 mM de ácido maleico 150 mM NaCl (pH 7,5). Marc Modificado Ringers (MMR), 10 veces más Sive y col., 2000 53 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM CaCl 2 5 mM de HEPES pH ajustado a 7,4 con NaOH 0,1 X MMR también contiene 50 mg / ml de sulfato de gentamicina y el pH se ajustó a 7,4 con NaOH. Solución MEMFA, 10X Sive y col., 2000 53 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO 4 3,7% de formaldehído Una solución de 10 veces, sin formaldehído, se puede almacenar a 4 ° C. El formaldehído se añadió fresco (1/10 de volumen de un patrón madre 37%). En tampón de hibridación in situ Sive et al., 2000 53 50% de formamida 5X SSC 1 mg / ml de ARN Torula 100 mg / ml de heparina Solución Denhart 1X de 0,1% de Tween 20 CHAPS 0,1% 10 mM EDTA. Soluciones. * Gentamicina, un antibiótico, se usa en nuestras soluciones MMR mientras penicilina y estreptomicina se utilizan en los medios de nuestra cultura.