Disección, Cultura y Análisis de<em> Xenopus laevis</em> Tejido de la retina embrionaria

Summary

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Abstract

El proceso por el que la región anterior de la placa neural da lugar a la retina de vertebrados sigue siendo un foco importante de investigación tanto clínica como básica. Además de la evidente importancia médica para la comprensión y el tratamiento de enfermedades de la retina, el desarrollo de la retina de vertebrados continúa sirviendo como un importante sistema modelo y elegante para la comprensión neuronal determinación de tipo celular y la diferenciación ^1-16. La retina neural consta de seis tipos de células discretas (ganglio, fotorreceptores amacrinas, horizontal,, células bipolares, y las células gliales de Müller) dispuestas en capas estereotipadas, un patrón que es muy conservada entre todos los vertebrados ^12,14-18.

Si bien el estudio de la retina en el embrión en desarrollo está intacto claramente necesaria para la comprensión de cómo este órgano complejo se desarrolla a partir de una protuberancia del cerebro anterior en una estructura en capas, hay muchas preguntas que benefician from empleando métodos que utilizan cultivos celulares primarios de presuntas células de la retina ^7,19-23. Por ejemplo, el análisis de las células de los tejidos y se disocia en diferentes etapas permite discernir el estado de la especificación de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, es decir, el destino de las células en la ausencia de interacciones con los tejidos vecinos ^{8,19-22 ,24-33.} Cultivo de células primarias también permite al investigador para tratar el cultivo con reactivos específicos y analizar los resultados en un nivel de célula única ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, un sistema modelo para el estudio clásico de desarrollo neural temprano ^{19,27,29,31-32,40-42,} sirve como un sistema particularmente adecuado para el cultivo de células primarias de retina ^10,38,43-45.

Tejido de la retina presuntiva se puede acceder desde las primeras etapas de desarrollo, inmediatamente después de la inducción neural ^25,38,43. Además, dado then cada célula en el embrión contiene un suministro de yema de huevo, células de la retina pueden ser cultivadas en un medio de comunicación muy simples definidos que consisten en una solución salina tamponada, eliminando así los efectos de confusión de incubación o de otros sueros de los productos basados ​​en ^10,24,44-45 .

Sin embargo, el aislamiento del tejido de la retina de los tejidos circundantes y el posterior procesamiento es un reto. Aquí, se presenta un método para la disección y disociación de las células de la retina en Xenopus laevis que se usa para preparar cultivos de células primarias que, a su vez, se analizó la actividad de calcio y la expresión génica en la resolución de las células individuales. Si bien el tema presentado en este documento es el análisis de los transitorios de calcio espontáneos, la técnica es ampliamente aplicable a una amplia gama de temas de investigación y enfoques (Figura 1).

Protocol

Todos los experimentos se llevan a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Colegio de William y Mary. Etapas de desarrollo hace referencia en este protocolo son de acuerdo a Nieuwkoop y Faber 46. 1. Disección Permitir que el medio de cultivo celular y medio libre de calcio magnesio (CMF) se equilibre a temperatura ambiente. Usted también necesitará Modificado 0,1 X de Marc Ringer (MMR) pH 7.4-7.6. E…

Representative Results

Ejemplos de éxito disecados vesículas ópticas (etapa 25) y retinas (etapa 35) se muestran en las Figuras 2E y 2J. Aunque este protocolo se puede utilizar en varias etapas de desarrollo, es crítico para obtener sólo tejido de la retina para asegurar la precisión para experimentos adicionales. Retire con cuidado la epidermis en todo momento y asegurarse de que las pinzas no perforar el tejido de la retina. En la etapa 35 años o más, la lente puede ser visto como una capa transparente en la parte s…

Discussion

Con sus tipos celulares bien caracterizadas que se conservan en todos los vertebrados, la retina proporciona un modelo útil para el estudio de los procesos moleculares-celulares que regulan la especificación del tipo de célula y la diferenciación. Cultivo celular primario proporciona un método potente para la investigación de una gran variedad de procesos que incluyen la expresión génica, la dinámica de proteínas y el calcio y la actividad eléctrica en el nivel de resolución única célula. A continuación l…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.