Dissection, культуры и анализ Published: December 23, 2012 doi: 10.3791/4377

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Molly J. McDonough*¹, Chelsea E. Allen*¹, Ng-Kwet-Leok A. Ng-Sui-Hing¹, Brian A. Rabe¹, Brittany B. Lewis¹, Margaret S. Saha¹

¹Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

Summary

Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.

Abstract

Процесс, при котором передней части нервной пластинки приводит к сетчатке позвоночных продолжает оставаться одним из основных направлений клинических и фундаментальных исследований. В дополнение к очевидной медицинской значение для понимания и лечения заболевания сетчатки, развитие позвоночных сетчатки продолжает служить важным и элегантная модель системы для понимания нейронных определения типа и дифференцировки клеток ^1-16. Нейронных сетчатка состоит из шести отдельных типов клеток (ганглии, амакринные, горизонтальные, фоторецепторы, биполярные клетки, а клетки глии Мюллера), расположенных в стереотипных слои, шаблон, который в значительной степени сохраняется среди всех позвоночных ^12,14-18.

При изучении сетчатки в неповрежденной развивающегося эмбриона явно необходимы для понимания того, как это сложный орган развивается из выпячивания мозга в слоистую структуру, есть много вопросов, которые приносят сюдам применения подходов с использованием первичной культуры клеток предполагаемого клеток сетчатки ^7,19-23. Например, анализ клеток из тканей удаляется и диссоциированных на различных этапах позволяет выявить состояние спецификация отдельных клеток на разных стадиях развития, то есть, судьба клеток в отсутствие взаимодействия с соседними тканями ^{8,19-22 ,24-33.} Первичные культуры клеток также позволяет следователю относиться к культуре специфических реагентов и анализировать результаты на одном уровне клетки ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus Хепориз, классическая модель системы для изучения раннего развития нервной ^{19,27,29,31-32,40-42,} служит особенно подходящей системой для сетчатки первичной культуре клеток ^10,38,43-45.

Фиксированные ткани сетчатки доступна с самых ранних стадиях развития, сразу после нейронной индукции ^25,38,43. Кроме того, учитывая йв каждой ячейке в эмбрион содержит поставку желток, клетки сетчатки можно культивировать в очень простой определены сред, состоящих из буферного солевого раствора, удаляя при этом смешанное воздействие инкубации сыворотки или других продуктов на основе ^10,24,44-45 .

Тем не менее, изоляция ткани сетчатки от окружающих тканей и последующая обработка является сложной задачей. Здесь мы представляем метод для вскрытия и диссоциации клеток сетчатки в Xenopus Хепориз, который будет использоваться для подготовки первичных культур клеток, что, в свою очередь, быть проанализированы на активность кальция и экспрессии генов при разрешении отдельных клеток. В то время как темы, представленные в этой работе является анализ спонтанной переходных кальция, техника широко применима к широкому кругу вопросов исследования и подходы (рис. 1).

Protocol

Все эксперименты проводятся следующие протоколы утвержденные Институциональные уходу и использованию животных комитета в Колледже Уильяма и Мэри. Стадии развития, указанные в данном протоколе в соответствии с Nieuwkoop и Фабера ^46.

1. Диссекция

1. Разрешить среду клеточной культуры и Кальций Магний Бесплатные Средний (CMF), чтобы уравновесить до комнатной температуры. Вам также понадобится 0,1 X Марка изменения Рингера (MMR) рН 7.4-7.6.
2. Стерилизовать следующих пунктов путем применения ультрафиолетового света в течение 30 мин в ламинарный поток клетку капот культуры. (Спрей каждого пункта с 70% этанола до размещения в капюшоне.)
   • 35 мм пластиковых чашках Петри.
   • 60 мм пластиковые чашки Петри.
   • 35 мм блюд поверхности Nunclon.
   • Пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге.
   • p1000 микропипетки (1.000 мкл пипетки).
   • Аэрозоль устойчивы p1000 советы (1.000 мкл аэрозоля микропипетки устойчивы советов).
   • Алкогольустойчивыми пера.
   • Изобразительное диссекции.
   • * 15 мл конические пробирки (только для визуализации активности кальция).
   • * Только для визуализации кальция деятельности.
3. Как только капот УФ стерилизовать и решения имеют доведены до комнатной температуры, включите ламинарного потока воздуха в капюшоне, спрей вниз перчатки и средства массовой информации бутылками с 70% этанола и место средств массовой информации бутылок в капюшоне.
4. Внутри капота подготовить следующие с p1000 микропипетки для каждой пластине клеток, обеспечение соответствующей маркировки.
   • Один 60 мм пластиковые чашки Петри, содержащую 10 мл клеточной культуры Medium - Dissection плиты.
   • Один 35 мм поверхности посуды Nunclon, содержащий 2 мл клеточной культуры Medium - Культура плиты. (Посуда пластиковая Nunclon в дальнейшем не рассматриваются с любыми клеями.)
   • Одна пустая 1,5 мл микроцентрифужных трубы эксплантов Диссоциация Tube.
   • * Один 15 мл коническую соколпробирку, содержащую 15 мл клеточной культуры Medium. Для вымывания избыточного Fluo4-AM, когда изображение кальция деятельности.
5. Внутри капот, подготовить следующие с p1000 микропипетки для каждого рассечения сессии (более одного сетчатки можно разрезать за один сеанс).
   • Один 35 мм пластиковые чашки Петри, содержащие 2 мл CMF - эксплантов Промыть пластины.
   • Один 35 мм пластиковые чашки Петри, содержащие 2 мл CMF - эксплантов Диссоциация плиты.
6. Вне капотом подготовить следующие:
   • Один 60 мм пластиковые чашки Петри на пластину клеток, содержащих 10 мл 0,1 X MMR - Проведение плиты.
   • Один 60 мм пластиковые чашки Петри на пластину клеток, содержащих 10 мл 0,1 X MMR - братьев и сестер плиты.
   • Один 60 мм пластиковые чашки Петри на вскрытие сессии, содержащий 10 мл 0,1 X MMR + 0,5 мг / мл MS-222 (Tricaine) - обезболивание плиты.
пластине эксплантов диссоциации (в результате 0,1% раствора трипсина), вихрем перемешать и отставить в сторону.
7. Если рассечение эмбриона, который моложе этапе 30, добавить 10 мг коллагеназы B к Dissection плиты (в результате 1 мг / мл раствора коллагеназы B), водоворот, чтобы растворить и отложите в сторону.
8. Выберите эмбриона нужного этапа, переход к крепежной пластины с нестерильных передачи пипетки, и удалить желточной оболочки (если эмбрион еще не вылупились) с использованием тонких щипцов.
9. Передача нескольких одинаково постановке эмбрионов Sibling Тарелка с нестерильных передачи пипетки.
10. Если эмбрион стадии 25 или ранее, перейдем непосредственно с рассечением, в противном случае передать эмбрион обезболивания Тарелка с нестерильных передачи пипетки и позволяют эмбриона сидеть до движение и ответ на раздражители прекращается. Это может занятьс точностью до минуты.
11. Продолжайте диссекцию (рис. 2) под рассекает область (4X цели, 10X окуляров).

Для стадии эмбриона 25 или моложе:

13. Перенос эмбрионов в Dissection Тарелка с нестерильных передачи пипетки.
14. Использование двух пар тонких щипцов, чтобы midsagittal разреза на брюшной стороне зародыша, начиная с заднего конца и вплоть до цемента железы в передней части зародыша.
15. Аккуратно откройте эмбриона, держа Ваш края разреза и распространение влево и вправо. В результате эмбрион с спинной стороне, обращенной в Dissection плиты, и с вентральной эктодермы распространять, открывая энтодермы и мезодермы внутрь.
16. Начните снимать энтодермы и мезодермы (рис. 2А и 2В). Первый и самый большой слой этой ткани очень "пушистые" по внешнему виду скрупные клетки и мало очевидных организации.
17. После удаления этого слоя, сомитов и хорды станет видимым. Для лучшего контраста, переместить эмбриона в отдельный 60 мм пластиковые чашки Петри, содержащую 10 мл клеточной среде Культура и 100 мкл 1% раствора сульфата нильского голубого (в воде) в течение 2-3 мин до передачи обратно в Dissection плиты. Это пятно эктодермы, сомитов, а хорды для облегчения идентификации и ориентации.
18. Ориентируясь на передней части эмбриона, осторожно удалите хорды и мезодермы оставшиеся подвергая мозг и глазные пузыри (рис. 2С).
19. Как только мозг и глазные пузыри полностью разоблачена, используйте щипцы, чтобы разорвать нервной трубки и основного эктодермы только позади мозга.
20. Включите эту часть (мозг и глазные пузыри) над тем, что эктодерма находится на вершине.
21. Забота, чтобы не повредить основные оптические пузырьки, вновь тщательнопереместить эктодермы (рис. 2D).
22. Наконец, с помощью пинцета, отделить глазные пузыри от мозга (рис. 2D и 2E).

Для эмбрионами старше этап 25:

23. В то время как эмбрион в анестезии плиты, удалите брюшной части эмбриона с пинцета.
24. Для лучшего контраста, переместить эмбриона 60 мм пластиковые чашки Петри, содержащую 10 мл 0,1 X MMR и 100 мкл 1% сульфат нильского голубого в течение 2-3 мин до передачи в Dissection плиты. Это пятно эктодермы синий.
25. После того как в Dissection плиты, отступить эктодермы вышележащих сетчатки (или глазной пузырь для эмбрионов на стадии 26-30) (рис. 2F и 2G). Если Нил синий сульфат был использован, эктодермы будет окрашен в голубой цвет, но основной ткани сетчатки не будет.
26. Удалить сетчатки или зрительного пузырька тщательно лrceps (рис. 2Н, 2I и 2J). Это полезно для хранения эмбриона в месте с одной парой щипцов и удаления сетчатки или зрительного пузырька с другом.

2. Диссоциации тканей и клеток Покрытие

Важное примечание - При передаче тканей, не позволяют сетчатки или зрительного пузырька коснуться любого воздушно-жидкостной границы, если это происходит, клетки лизируются.

1. После глазной пузырь или сетчатки были расчленены, аккуратно перенести на эксплантов Промыть пластины с p100 микропипетки использованием аэрозолей устойчивы советы и позволить сидеть в течение 30 сек.
2. Передача 80 мкл 0,1% трипсина в CMF из эксплантов плиты Диссоциация к трубе эксплантов диссоциации.
3. С помощью микропипетки p100 и аэрозольного устойчивы советов, передает сетчатка или зрительный пузырек из эксплантов Промыть пластины в эксплантов Dissociatiна трубы, избегая передачи эксплантов промыть раствором.
4. Дайте ткани диссоциировать в метро эксплантов Диссоциация в течение 1 часа при комнатной температуре. Один сетчатки был использован на пластину, однако отметим, что можно использовать более одного пластины при желании увеличить количество клеток на чашку.
5. Для пластины клетки, сначала медленно удалить 40 мкл раствора от станции метро эксплантов диссоциации и выбросить помощью микропипетки p100 и аэрозольного устойчивы советы. Использование p100 набор до 40 мкл и аэрозолей устойчивы советов, передает клеток (теперь, когда ткань имеет диссоциированных) к культуре плиты. При аспирации клеток на тарелку, пипетка медленно и удерживает клетки на небольшой площади в центре пластины.

Примечание: Если несколько изображений клеток, которые должны быть приняты в течение всего эксперимента, прикрепить сетку (Cellattice) к нижней плиты культуры

6. Разрешить клетки, чтобы сидеть спокойно, по крайней мере 1 час присоединиться к Nunclon пластины. По истечении этого времени, они должны относиться очень осторожно, или они могли оторваться.
7. Культуры клеток к желаемой стадии, наблюдая за братом эмбрионов, которые выращиваются при той же температуре, как клетки. Если живые клетки, которые не используются для дальнейших манипуляций, они могут быть зафиксировано в решении MEMFA в это время.

Важное примечание: Большинство наших экспериментов фиксируются в течение 6 ч посеве клеток. Продолжительность жизни клеток в культуре зависит от стадии, на которой ткань была расчленена и количество желтка еще присутствует в клетках, клетки расчлененный от младшего (нейрулы этапов) оставаться здоровым в культуре в течение 5-6 дней, в то время как клетки, приобретенные у старший эмбрионов (плавание головастиковэтапов) будет оставаться жизнеспособными в культуре в течение 2-3 дней.

3. Кальций изображений ^47-49

Этот протокол используется кальций-чувствительных Fluo4-AM и конфокальной микроскопии в количественном кальция переходные процессы в отдельных клетках. Все шаги, используя Fluo4-AM должна быть выполнена в защищенном от света, как Fluo4-AM является чувствительной к свету. Все промывки должны быть добавлены или удалены с помощью p1000 микропипетки и аэрозолей устойчивые советы. Пипетирование должно быть сделано медленно и к краю пластины, чтобы избежать нарушения клеток. СМИ не изменилось, потому что культурах, как правило, установлен в течение 6 часов, чтобы быть расчленены. Для более долгосрочных культуры, средств массовой информации следует менять ежедневно.

1. Fluo4-AM хранится при температуре -20 ° C, и мы предлагаем хранении в 5 мкл аликвоты. Перед использованием таять 5 мкл аликвоты Fluo4-AM вдали от света и добавить 2 мкл Pluronic F-127 для этого аликвоты.
2. После культивирования клеток в течение необходимого количества времени (по крайней мере,1 час), удалите 1 мл среды культуры клеток из культуры плиты. Добавьте к этому Fluo4-AM и Pluronic, смешивая осторожным пипетированием.
3. Медленно перенести все это решение обратно к краю плиты культуры клеток для включения в образ и оставлять клеток в этом растворе в покое на 1 час, чтобы поглотить Fluo4-AM.
4. Чтобы вымыть лишний Fluo4-АМ из среды культуры клеток, выполните следующие серии стирки:
   • Удалить 1 мл среды от пластины.
   • Добавьте 3 мл свежей среды культуры клеток (от 15 мл коническую трубку) к плите.
   • Выполните два дополнительных моет, каждый раз, медленно удаляя 3 мл раствора из пластин и добавлением 3 мл свежей среды для культивирования клеток.
5. Клетки должны теперь быть в 4 мл клеточной культуральной среде и содержат Fluo4-AM. Fluo4-AM ферментативно расщепляют раз внутри клетки, не давая ему диффундирующего из клетки или в любой мембраносвязанных отсеков. Перед загрузкой пластин на сцену конфокальной микроскопии для визуализации, проведите вертикальную красную линию с постоянным маркером на блюде, держа крышку, чтобы предотвратить маркер частицы загрязняющих культуры. Вертикальная линия вниз стороне чашки Петри (основание чашки Петри, а не на крышке). Его целью является, чтобы указать ориентацию культуры пластины по отношению к полю зрения, так что точной ориентации и выравнивание отдельных клеток может быть восстановлен на более позднем этапе.
6. Пластина готова к загрузке на этапе конфокальной микроскопии для визуализации. Визуализация клеток с использованием ярких параметры поля на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (цель 20X). Найти площадь плотных клеток, которые не содержат сгустки, желательно с поля зрения, которая содержит большое количество сетки на покровное Cellatice, чтобы найти то же самое поле зрения легче позже, когда изображение культуру после того, как в сиТу гибридизации. До изображений, сосредоточиться вниз по культуре и принять яркое изображение поля сетки ниже клетки для записи местоположения и ориентации культуры клеток. Это позволяет перестройки клеток для последующего анализа.
7. Поднимите фокальной плоскости и захватить яркое поле изображения клеток до начала кальция изображения (рис. 3А).
8. Как только центр плоскости клетки находится в фокусе, плита готова для работы с изображениями кальция деятельности. Настройки будут меняться в зависимости от микроскопа и приложения. Мы изображений клеток с использованием аргона 488 нм лазер для 1, 2, или 12 часов со следующими параметрами:
   • 1 час изображения:
     • Argon 488 нм лазер сканирует на 4% своей максимальной мощности 30 мВт.
     • Сканирование раз в 4 сек (900 сканирований в час).
   • 2 часа изображений:
     • Argon 488 нм лазер сканирует на 4% своей максимальной мощности 30 мВт.
     • Сканирование раз8 сек (450 сканирований в час).
   • 12 ч. изображения:
     • Argon 488 нм лазер сканирует на уровне 2% от максимальной мощности 30 мВт.
     • Сканирование раз в 48 сек (75 сканирований в час).

Эти параметры будут приводить в набор из 900 фотографий кадр для каждого периода времени. Кальций деятельности могут быть записаны путем анализа флуоресценции уровней за время курса изображения (рис. 3В) с использованием приложений обработки изображений, такие как ImageJ ^50.

4. Фиксация клеток

1. После обработки изображений, клетки могут быть исправлены в течение 30 минут, удаляя 3 мл раствора из пластин и добавлением 1 мл 2X MEMFA на оставшиеся 1 мл культуральной среды.
2. После фиксации удалить MEMFA и обезвоживает клетки с серии 5 минут моет, каждый объемом 1 мл:
   • 25% этанола в 1X фосфатным буферным раствором (PBS).
   • 50% этанола в 1X PBS.
   <li> 75% этанола в SDD H ₂ O (стерильной деионизированной дистиллированной воды).
   • Заменить последний мыть с 1 мл 100% этанола и хранят пластины при температуре -20 ° C.

Примечание: Метанол может также использоваться для этих моет и для хранения.

5. Флуоресцентный в гибридизация (FISH)

Культуры могут быть проанализированы, используя стандартный протокол рыбы Xenopus, как описано ⁵¹ с модификациями для культуры клеток, как это изложено Андерсон Лаборатория ^52. Изменения в Anderson Лаборатории протокола, перечислены ниже. Все промывки проводятся на 35-мм пластин Nunclon в объеме примерно 1 мл, если не указано иное. Решения, как определено в Sive и др. ^53. Если не указано иное.

Важное замечание: не используйте флуоресцеина-меченных РНК-зондов при выполнении в гибридизация на клетки, отображаемого накальция деятельности. Anti-флуоресцеина антитела будут связываться с остаточным Fluo4-AM в клетках и может привести к позитивным сигналом для всех клеток в культуре.

День 1: пермеабилизации и гибридизация

1. Регидратация моет должно быть этапным для обезвоживания растворителя, используемого для хранения. Для наших экспериментов, моет были отнесены к этанолу в 1X PBS.
2. После регидратации, мыть клетки еще три раза в 1X PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
3. Смешайте 25 мл 0,1 М триэтаноламина (рН 8,0) с 62,5 мкл уксусного ангидрида в трубке Сокол и быстро перемешать до полного рассеяны, как описано в Anderson Лаборатория ⁵² протоколов. Инкубируют культуры в этой смеси в течение 10 мин при комнатной температуре. После уксусного ангидрида лечения, мыть клетки 1X солевой цитрат натрия (SSC) в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Удалить последней промывки SSC и заменить 0,2 М HCl (в SDD H ₂ O) в течение 10 мин до permeabilize клеток. </ Li>
5. Промойте HCl с двумя промывками в 1X PBS в течение 5 мин.
6. Prehybridize в ISH буфера при 60 ° C в дрожащей водяной бане в течение как минимум 6 часов, но не prehybridize ночь, так как это сильно уменьшает сигнал.
7. Гибридизации в течение ночи при 60 ° С в течение 8-14 ч в 750 мкл разведенного зонда (1:250 разведение от зонда очищенный). Очищенный диапазоне концентраций от зонда 1.0-1.5 мкг / мкл.

День 2: Удаление зонда Unbound и антител Инкубационный

8. Снимите датчик и промыть культур в течение 5 мин в 0,2 X SSC при 60 ° C. Стирать в свежих 0.2X SSC в течение 1 часа при 60 ° C.
9. Удалить культур из водяной бани и дать им возможность адаптироваться к комнатной температуре в течение 5 мин.
10. Промыть в 0.2X SSC при комнатной температуре в течение 5 мин.
11. Промойте в течение 15 мин в 1X PBS с 0,1% Triton-X-100 (PBT).
12. Для инактивации эндогенной пероксидазы, мыться в течение 1 ч в 2% H ₂ O ₂ решения в PBT.
13. Блок в 2% блокирующий реагент в Малеиновый буфера кислота (МАБ) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мы обнаружили, что этот метод блокирования увеличивает чувствительность по сравнению с предыдущими методами блокировки в 20% овечьей сыворотки в PBT.
14. Инкубируют культуры в 1 мл 2% блокирующий реагент в МАБ содержащие 1:1000 разведение POD-конъюгированных антител в течение ночи при 4 ° C.

День 3: Удаление несвязанных антител и флуоресцентного развития

16. Удалите раствор антител и промыть 3 раза в TBST в течение 5 мин при комнатной температуре.
17. Промойте 4 раза в TBST в течение 15 мин при комнатной температуре непрерывно качалки на медленной скорости.
18. Мыть два раза в PBT при комнатной температуре в течение 10 мин.
19. Применить 750 мкл 1:200 флуоресцеином tyramide или 1:25 Cy3 tyramide разводят в PBT. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре и добавляют 2,5 мкл 0,3% H ₂ 2. Рок в течение 40 мин, чтобы сигнал развиваться.
20. Мойте по крайней мере 4 раза в течение 15 минут в каждом из TBST при комнатной температуре с качалки.
21. Как только сигнал полностью разработана, мыться в течение 5 мин в 1X PBT.
22. Исправить в 1X MEMFA в течение 1 часа при комнатной температуре и хранят в 1X PBS при 4 ° C.

6. Изображение FISH результаты и сотрудничеству регистрации данных кальция изображений

1. После завершения рыбы, тарелки культуре клеток загружаются чтобы определить, какие клетки отображения положительный сигнал флуоресценции для данного датчика. Используйте Cellattice покровное, чтобы найти точное поле зрения изучались в процессе кальция изображений и выравнивания пластин с ориентацией рамки кальция изображения.
2. Фокус в центре плоскости клетки и принять одно высокое разрешение изображения с помощью гелий-неоновый гелий-неоновый лазер 543 нм при 15% от максимальной мощности 1 мВт (рис. 3).
3. В оригинале 900 кадров набор изображений, полученных из протокола изображений кальция,идентифицировать отдельные клетки регионах, представляющих интерес (РИ) с помощью программы обработки изображений (такие, как ImageJ ^50). Извлечение ROI флуоресценции данных в виде набора точек данных, представляющих времени флуоресценции пары значений (рис. 4).
4. Наложение изображений FISH результаты с выявленными трансформирования из кальция изображения (рис. 3D).
5. Регистрация каждого ROI как положительную для зонда, негативный для зонда, или неизвестные - в случае, если ячейку, соответствующую рентабельность не может быть найдено в поле зрения рыбы изображения.
6. Процесс ROI флуоресценции данных с использованием статистических сценарии анализа (как она была задумана через MATLAB или других языков программирования), чтобы сравнить уровни кальция деятельности среди различных расчлененных этапов (рис. 5А и 5С) или клеток, позитивных для различных зондов FISH (рис. 5В и 5D). Все скрипты, используемые в нашей лаборатории находятся в свободном доступе по запросу.

Representative Results

Примеры успешного расчлененный глазные пузыри (этап 25) и сетчатки (этап 35), показаны на рисунках 2E и 2J. Хотя этот протокол может быть использован на различных этапах развития, очень важно получить только ткани сетчатки, чтобы обеспечить точность для дальнейших экспериментов. Осторожно снимите эпидермиса на всех этапах и убедитесь, что ваш щипцами не прокалывать ткань сетчатки. На стадии 35 лет и старше, объектив можно рассматривать как прозрачный слой поверх сетчатки и могут быть удалены путем осторожного соскоба с помощью пинцета.

Успешно покрытием первичной культуре клеток показано на рисунке 3А. При диссоциации ткани, важно не оставлять сетчатки эксплантов в промывной раствор для дольше чем рекомендуемый 30 сек инкубационный период для предотвращения ткани от диссоциирующих в промывной раствор. Кроме того, убедитесь, что ткань разрешается диссоциируют в растворе трипсина в течение часа(Более старых эмбриональной и личиночной стадии может потребоваться даже больше), что позволяет равномерное распределение клеток в культуре пластины. Как только клетки покрытием, проявлять осторожность при перемещении пластин и изменения решений, чтобы избежать промывки клеток от пластины.

Цифры 3В и 3С демонстрировать изображения с кальцием сканирование активности и флуоресцентные на месте гибридизации (FISH), соответственно. Клетки, которые появляются ярко-зеленого в изображении кальция являются клетки, которые переживают переходный всплеск внутриклеточной концентрации кальция в результате выпуска внутренних магазинах кальция. Клетки могут быть исследованы на экспрессию генов использованием рыбы и моделей экспрессии генов могут быть соотнесены с особенностями кальция пики активности путем наложения изображений (рис. 3D). Используя комбинацию Python и MATLAB скриптов (в свободном доступе по запросу), данные получены на основе анализа флуоресценции деятельности каждого индивидуальноАль области интереса (ROI) по ходу изображения. Например кальция деятельности для отдельной ячейки (ROI) в течение 1 ч визуализации показан на рисунке 4; шипованные видна примерно на 57 мин визуализации. В таблице 1 репрезентативных данных по процент клеток, положительных для различных зондов показано, в то время как нет никаких данных, специфичных для данного эксперимента описаны в литературе (точка нашего нынешнего эксперимента состоит в определении этих процентах), наши данные согласуются с Данные от аналогичных типов экспериментов, связанных с кальцием активности в спинном мозге ^17,55,56.

Параметры используются для анализа включают в себя количество, частота и амплитуда пиков. Рисунке 5 обеспечивает репрезентативные результаты визуализации кальция и FISH эксперименты в эмбриональных клеток сетчатки с помощью зондов для xVglut1, Ptf1a, и xGAD67. Использование MATLAB скриптов, количество лучей для ВАСч ROI определяется и количеством шипов усредняется для всех трансформирования в эксперименте. Среднее число шипов от каждого эксперимента могут быть скомпилированы с другими экспериментами, в результате чего в среднем по группе экспериментов. Полезных участков распределения могут быть созданы для отображения распределения среднее число шипов для всех экспериментах в группе. MATLAB скрипты которые затем используются для статистического анализа данных.

На рисунке 5 показаны репрезентативные данные после анализа MATLAB. Короче говоря, наши результаты показывают, что кальций деятельность регулируется развитием, с пики достигнув стадии 35 (р <0,002) (рис. 5А и 5С). С точки зрения соотнесения кальция деятельность с клетками положительными для конкретного зонда, в то время не было статистически значимых различий, однако наблюдалась тенденция (р = 0,08) для клеток, положительных для xGAD67 (маркер дифференцированных клеток ГАМКергических) для отображения Highe Г уровни кальция пики активности, чем положительных клеток для глутаматергической маркером или Ptf1a, ген, кодирующий фактор транскрипции гена коррелирует с содействию GABAeric фенотип. Хотя предварительные, эти данные свидетельствуют о том, что может быть ГАМКергических клеток, которые развиваются таким образом, зависит от Ptf1a или иной деятельности зависит от нейромедиатора спецификация не действует на уровне Ptf1a.

Рисунок 1. Процедурные схемы. Однажды ткани сетчатки расчленена и диссоциированных, первичной культуре клеток может быть использована для широкого спектра приложений.

s.jpg "/>
Рисунок 2. Препарирование фотографии. Эмбрионы были окрашены в синий Нил сульфат для увеличения контраста. А.Е.: Этап 24. FJ: Этап 35. Сокращения:. О.В., глазной пузырь, FB, передний мозг, подкожно, спинного мозга; меня, мезодерма, так что, сомитов; ле, линзы; CG, цементные железы; повторно, сетчатки; ер, эпителий Нажмите для увеличения рисунка .

Рисунок 3. Изображения культуре клеток с трансформирования круг. A. Светлое поле. B. Изображение после Fluo-4 (AM) лечения трансформирования круг. C. FISH изображения (стрелки показывают примеры положительных клеток для альфа-субъединицы напряжения закрытого кальциевых каналов CaV2.1). D. Наложение светлого поля, Fluo-4, и рыба изображений.

7/4377fig4.jpg "ALT =" Рисунок 4 "FO: содержание ширина =" 3.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4. Пример кальция деятельности для одной ячейки (ROI). Сюжет флуоресценции (в относительных единицах флуоресценции, РФС) от времени (в минутах) от Fluo4 изображение флуоресценции кальций.

Рисунок 5. Результаты отображаются кальция пики на сцене и зонд. A. Среднее количество кальция шипы на стадии 30 (п = 4), 35 (п = 8), и 38 (п = 13). B. Среднее количество кальция шипы в культуре различных зондов, используемых для в гибридизация на стадии 35 xVglut1 (п = 3), xGAD67 (п = 3), а Ptf1a (п = 4). C. полезных участка распределения среднее число шипов в культуре на 30 этапов, 35, 38. D. полезных распрена участке среднее число шипов в культуре клеток определены как имеющие положительный сигнал для зондов на месте гибридизации на стадии 35;. xVglut1, xGAD67, и Ptf1a Нажмите для увеличения рисунка .

Зонд	Этап	п (пластины)	п (клеток)	Процент положительных
xGAD67	35	4	1042	2%
	38	4	690	2%
Ptf1a	30	3	352	1%
	35	6	1856	1%
xVglut1	30	1	47	57%
	35	3	692	2%
	38	3	364	4%

Таблица 1. Процент положительных клеток.

Discussion

Благодаря хорошо изученных типов клеток, которые сохраняются во всех позвоночных животных, сетчатка представляет собой полезную модель для изучения молекулярно-клеточные процессы, определяющие ячейки спецификации типа и дифференциации. Первичные культуры клеток дает мощный метод исследования широкого спектра процессов, включая экспрессию генов, белков динамику, и кальций, и электрическая активность на уровне одной резолюции клетки. Здесь мы представляем простой метод для первичной культуры клеток от расчлененного предполагаемого ткани сетчатки в Xenopus Хепориз, особенно актуален в организме для таких исследований, учитывая, что предполагаемый сетчатки легко добраться из самых ранних стадиях развития и, что первичные культуры клеток может происходить в определены сред, состоящих из простых физиологическим раствором.

Хотя легко адаптируются к самым лабораторных условиях, есть несколько шагов, которые требуют особо пристального внимания. DissectiДополнения должны быть выполнены с недавно заостренные щипцы. Младший этапов (<ул. 30) пользы от лечения коллагеназы B смешивается с клеточной культуральной среды. Все действия, связанные с передачей ткани или клеток из одной среды в другую должны быть выполнены с особой тщательностью, чтобы предотвратить ткани или клеток от вступления в непосредственной близости от воздушной раствор. Пипетки содержащие ткани должен быть полностью погружен в большое количество жидкости и клеток или тканей изгнан очень медленно. После того, как клетки были покрыты, все жидкости, включая переводы, Fluo4-AM Кроме того, и средний культуре клеток, или фиксации мойки, должны быть тщательно выполнены, учитывая, что клетки могут быть легко смещаются. Как и во всех клеточных культур, бесплодие опасения, так следует позаботиться о стерилизации всех материалов. Наконец, позволяя диссоциированных сетчатки эксплантов сидеть назначенные сроки в среде диссоциация имеет решающее значение для успешной прикрепление клеток и, чтобы избежать слипания.

Во времявскрытие и культура условиях, описанных в этом протоколе, как некроз и апоптоз крайне ограничены (менее 5-10% клеток). Потеря клеток на пластине (апоптоз) редко заметил во время до и после сессий конфокальной изображения. Обработка культуры клеток тщательно имеет ключевое значение для жизнеспособности клеток. Решение изменения должны быть выполнены очень медленно и постепенно, чтобы предотвратить некроз клеток и апоптоз. В то время как эксперименты, чтобы очертить точные отношение типов клеток сетчатки в настоящее время продолжается, мы заметим, что разнообразие типов клеток сетчатки по всей видимости, быть представлен в культуре и, что глиальные клетки Мюллера (которые имеют различные морфологии) не являются доминирующими в культуре .

Потенциальной проблемой при анализе пластин после на месте гибридизации является то, что некоторые клетки, возможно, переехал, но это могут быть решены с использованием программ ячейки слежения. Кроме того, присущими технике первичной культуры клеток, основным ограничением является гоэлектронной очевидна потеря пространственного паттерна, который присутствует в неповрежденной ткани. Личность отдельные клетки должны быть установлены с использованием молекулярных анализов, а не по позиции в ткани. Однако, эта функция также дает возможность анализировать состояние спецификации клеток очень точно и в отсутствии продолжающегося межклеточных взаимодействий. Она также позволяет следователю выборочно относиться к клеткам с факторами роста или других соединений и точно анализировать эффекты без влияния сигналов от соседних клеток. В то время как мы использовали этот сетчатки вскрытие и первичной культуры клеток техники для сопоставления изображений с кальцием специфических маркеров фенотипа нейромедиатор, эта методика может быть адаптирована к широкому кругу других вниз по течению приложений, включая электрофизиологические записи и анализа одного гена клетки выражения с помощью RT-PCR или "Следующий поколения "транскриптом анализа (рис. 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart's Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.