Summary
Xenopus laevis ger en idealisk modell för att studera specifikation cellöde och fysiologisk funktion hos individuella retinala celler i primär cellkultur. Här presenterar vi en teknik för dissekera retinal vävnad och generera primära cellkulturer som avbildas för kalcium aktivitet och analyserades genom in situ hybridisering.
Abstract
Den process genom vilken den främre regionen av neurala plattan ger upphov till ryggradsdjur näthinnan fortsätter att vara ett stort fokus på både klinisk forskning och grundforskning. Förutom den uppenbara medicinska relevans för att förstå och behandla näthinnesjukdom, fortsätter utvecklingen av ryggradsdjur näthinnan att fungera som ett viktigt och elegant modell för att förstå neuronala celltyp bestämning och differentiering 1-16. Den neurala näthinnan består av sex separata celltyper (ganglion, amacrine, horisontella, fotoreceptorer, bipolära celler och Muller gliaceller) arrangerade i stereotypa lager, ett mönster som till stor del är bevarad bland alla ryggradsdjur 12,14-18.
Medan de studerar näthinnan i intakt utvecklande embryot är klart krävs för att förstå hur denna komplexa organ utvecklas från ett utsprång av framhjärnan till en skiktad struktur, det finns många frågor som gynnar tillbakam anställa metoder som använder primär cellkultur av presumtiva retinala celler 7,19-23. Till exempel, analysera celler från vävnader avlägsnats och dissocierad i olika skeden gör att man kan urskilja tillstånd specificering av individuella celler vid olika utvecklingsstadier, dvs öde cellerna i frånvaro av interaktioner med närliggande vävnader 8,19-22 ,24-33. Primär cellodling ger också utredaren att behandla kulturen med specifika reagens och analysera resultaten på en enda cell nivå 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ett klassiskt modellsystem för att studera tidig neural utveckling 19,27,29,31-32,40-42, fungerar som en särskilt lämplig för retinal primär cellkultur 10,38,43-45.
Presumtiv näthinnevävnad är tillgänglig från de tidigaste utvecklingsstadierna, omedelbart efter neural induktion 25,38,43. Med tanke på thvid varje cell i embryot innehåller ett förråd av äggula, kan retinala celler odlas i ett definierat mycket enkel medier bestående av en buffrad saltlösning och därmed undanröja de förbryllande effekterna av inkubering eller andra serum-baserade produkter 10,24,44-45 .
Emellertid är isoleringen av den retinala vävnaden från omgivande vävnader och den efterföljande bearbetningen utmanande. Här presenterar vi en metod för dissektion och dissociation av näthinneceller i Xenopus laevis som kommer att användas för att framställa primära cellkulturer som, i sin tur, kan analyseras för kalcium aktivitet och genexpression vid upplösningen av enskilda celler. Medan ämnet som presenteras i denna uppsats är en analys av spontana kalcium transienter är tekniken brett tillämpbar för ett brett spektrum av frågeställningar och metoder (figur 1).
Protocol
Alla experiment utförs följande protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid College of William and Mary. Utvecklingsstadier hänvisas till i detta protokoll är enligt Nieuwkoop och Faber 46.
1. Dissektion
- Låt cellodlingsmediet och Kalcium Magnesium medium (CMF) jämviktas till rumstemperatur. Du behöver också 0,1 X Marcs Modifierad Ringers (MMR) pH 7,4-7,6.
- Sterilisera följande genom att tillämpa en UV-ljus under 30 minuter i en cellkultur huv med laminärt flöde. (Spraya varje objekt med 70% etanol innan den placeras i huven.)
- 35 mm petriskålar av plast.
- 60 mm petriskålar av plast.
- 35 mm Nunclon yta rätter.
- 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- P1000 mikropipett (1.000 il mikropipett).
- Aerosol resistenta P1000 tips (1.000 il mikropipett aerosol resistenta tips).
- Alkoholresistenta penna.
- Fin dissekera pincett.
- * 15 ml koniska rör (endast för avbildning kalcium aktivitet).
- * Endast för avbildning av kalcium aktivitet.
- När huven är UV-steriliserad och lösningar har jämvikt till rumstemperatur, slå på laminärt luftflöde i huven, spraya ner handskar och media flaskor med 70% etanol och media placera flaskor i huven.
- Inuti huven förbereda följande med en P1000 mikropipett för varje platta med celler, vilket garanterar lämplig märkning.
- En 60 mm plast petriskål innehållande 10 ml cellodlingsmedium - Dissection Plate.
- En 35 mm Nunclon yta skål innehållande 2 ml cellodlingsmedium - odlingsplatta. (Nunclon plastskålar inte behandlas vidare med eventuella lim.)
- En tom 1,5 ml mikrocentrifugrör-Explantation Dissociation Tube.
- * En 15 ml konisk falkrör innehållande 15 ml cellodlingsmedium. För att tvätta ur överflödig Fluo4-AM när imaging kalcium aktivitet.
- Inuti huven, förbereda följande med en P1000 mikropipett för varje dissektion session (mer än en näthinnan kan dissekeras i en session).
- En 35 mm plast petriskål innehållande 2 ml CMF - Explantation Rinse Plate.
- En 35 mm plast petriskål innehållande 2 ml CMF - Explantation dissociation Plate.
- Utanför huven förbereda följande:
- En 60 mm plast petriskål per platta av celler som innehåller 10 ml 0,1 X MMR - fästplåten.
- En 60 mm plast petriskål per platta av celler som innehåller 10 ml 0,1 x MMR - Syskon Plate.
- En 60 mm plast petriskål per dissektion session innehållande 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaine) - bedövning Plate.
- Om dissekera ett embryo som är yngre än steg 30, tillsätt 10 mg kollagenas B till Dissection Plate (vilket resulterar i en 1 mg / ml kollagenas B-lösning), snurra för att lösa upp och ställ åt sidan.
- Välj ett embryo till det önskade stadiet, överföring till Holding plattan med en icke-steril överföringspipetten och ta bort vitellinmembranet (om embryot inte har kläckts) med fin pincett.
- Överför flera iscensatt identiskt embryon till Syskon plattan med en icke-steril överföringspipett.
- Om embryot är steget 25 eller tidigare, fortsätt direkt med dissektion, på annat sätt överföra embryot till bedövning plattan med en icke-steril överföringspipetten och låta embryot sitta tills rörelse och svar på stimuli upphör. Detta kan taupp till en minut.
- Fortsätt med dissektion (figur 2) under en dissektionsmikroskop (4X mål 10X okular).
För embryon steg 25 eller yngre:
- Överför embryo till Dissection plattan med en icke-steril överföringspipett.
- Med hjälp av två par av fin pincett, göra en midsagittal snitt på den ventrala sidan av embryot, med början på den bakre änden och fortsätter genom cement körtel i den främre delen av embryot.
- Öppna försiktigt embryot genom att ta tag på någondera kanten av snittet och sprida vänster och höger. Detta resulterar i ett embryo med den dorsala sidan riktad mot Dissection tavla, och med den ventrala ektodermet spred öppet avslöja endoderm och mesoderm inom.
- Börja bort endoderm och mesoderm (figur 2A och 2B). Den första och största skikt av denna vävnad är mycket "fluffigt" i utseende medstora celler och lite uppenbara organisation.
- Efter avlägsnande detta skikt kommer somiter och notokorden blir synliga. För bättre kontrast, flytta embryot till en separat 60 mm plast petriskål innehållande 10 ml cellodlingsmedium och 100 pl 1% lösning av nilblått sulfat (i vatten) under 2-3 min före överföring tillbaka till Dissektion Plate. Detta kommer att färga ektoderm, somiter och notokord för lättare identifiering och orientering.
- Fokusera på den främre delen av embryot, försiktigt bort notokorden och eventuella kvarvarande mesoderm utsätta hjärnan och optiska vesiklar (Figur 2C).
- När hjärnan och optiska vesiklar är helt exponerade, använd tången för att avskilja det neurala röret och underliggande ektoderm bara posteriort om hjärnan.
- Vrid denna del (hjärnan och optiska vesiklar) över så att ektoderm är på topp.
- Se till att inte skada de underliggande optiska blåsor, re noggrantflytta ektoderm (figur 2D).
- Slutligen, med pincett, separera de optiska vesiklarna från hjärnan (figur 2D och 2E).
För embryon äldre än steg 25:
- Medan embryot är i bedövning Plate, avlägsna den ventrala delen av embryot med pincett.
- För bättre kontrast, flytta embryot till en 60 mm plast petriskål innehållande 10 ml 0,1 X MMR och 100 ul 1% Nile Blue Sulfate för 2-3 minuter innan du överför till Dissection Plate. Detta kommer att färga ektoderm blå.
- Väl inne i Dissection Plate, dra tillbaka ektoderm överliggande näthinnan (eller optisk vesikel för embryon steg 26-30) (Figur 2F och 2G). Om Nilblått sulfat används kommer ektoderm att färgas blå men den underliggande näthinnevävnad inte.
- Ta bort näthinnan eller synnerven vesikel försiktigt med forceps (Figur 2H, 2I, och 2J). Det är bra att hålla embryot på plats med en pincett och ta bort näthinnan eller optiska vesikel med den andra.
2. Dissociation av vävnad och Plätering av celler
Viktigt - Vid överföring vävnader, inte tillåter näthinnan eller synnerven vesikel att röra någon luft-vätske gränser, om detta inträffar cellerna kommer lyseras.
- När den optiska vesikeln eller näthinnan har dissekerats, försiktigt överföra till Explantation Skölj plattan med en P100 mikropipett med aerosol resistenta spetsar och låt stå i 30 sek.
- Överför 80 ul 0,1% trypsin i CMF från Explantation Dissociation tavla till Explantation dissociation Tube.
- Med hjälp av en P100 mikropipett och aerosoler resistenta tips överföra näthinnan eller synnerven blåsa från Explantation Skölj plattan i Explantation Dissociatipå Tube, undvika överföring av explantaten skölj lösning.
- Låt vävnaden att dissociera i Explantation dissociation Rör under 1 timme vid rumstemperatur. En näthinnan användes per platta, men vi noterar att det är möjligt att använda mer än en per platta om så önskas för att öka antalet celler per platta.
- På plattan cellerna, först långsamt bort 40 | il av lösningen från Explantation dissociation Tube och kassera använda en P100 mikropipett och aerosol resistenta spetsar. Med hjälp av en P100 inställd på 40 pl och aerosoler resistenta tips överföra cellerna (nu när vävnaden har dissocierade) till odlingsplattan. När aspirering av cellerna på plattan, pipettera långsamt och hålla cellerna i ett litet område i mitten av plattan.
Obs: Om flera bilder av de celler som skall tas under hela experimentet, bifoga ett galler (Cellattice) till undersidan av odlingsplattan
- Tillåta cellerna att stå orörd under minst 1 timme för att vidhäfta till Nunclon plattan. Efter denna tid måste de behandlas mycket varsamt eller de kan lossna.
- Kultur celler till önskade stadiet genom att observera syskon embryona, som föds upp vid samma temperatur som cellerna. Om levande celler inte används för ytterligare manipulering kan de fixeras i MEMFA lösning vid den här tiden.
Viktigt: De flesta av våra experiment fastställas inom 6 timmar för plätering cellerna. Livslängden av cellerna i kulturen är beroende av i vilket skede vävnaden dissekerades och mängden äggula kvar i cellerna, cellerna dissekerade från yngre (neurula steg) förblir friska i kultur i 5-6 dagar medan celler som förvärvats från äldre embryon (simning grodyngelsteg) kommer att förbli livskraftig i kultur i 2-3 dagar.
3. Kalcium Imaging 47-49
Detta protokoll använder kalcium-känsliga Fluo4-AM och konfokalmikroskopi att kvantifiera kalcium transienter i enskilda celler. Alla steg som använder Fluo4-AM ska utföras borta från ljus, som Fluo4-AM är ljuskänsligt. Alla tvättar bör läggas eller tas bort med hjälp av en P1000 mikropipett och aerosol-resistenta tips. Pipettering bör ske långsamt och mot kanten av plattan för att undvika att störa cellerna. Media ändras inte på grund av att kulturerna fastställs i allmänhet inom 6 timmar för att bli dissekeras. För långsiktiga kulturer bör medierna bytas dagligen.
- Fluo4-AM lagras vid -20 ° C, och vi föreslår lagring i 5 | il alikvoter. Före användning, tina en 5 pl alikvot av Fluo4-AM borta från ljus och tillsätt 2 pl av Pluronic F-127 direkt till denna alikvot.
- Efter odling av cellerna under den önskade mängden tid (åtminstone1 timme), avlägsna 1 ml av cellodlingsmediet från odlingsplattan. Lägg detta till Fluo4-AM och Pluronic, blanda genom försiktig pipettering.
- Långsamt överföra alla av denna lösning tillbaka till kanten av odlingsplattan av cellerna som skall avbildas och lämna cellerna i denna lösning ostört under 1 timme för att absorbera Fluo4-AM.
- Att tvätta bort överskott Fluo4-AM från cellodlingsmediet, fyll i följande tvätt-serien:
- Avlägsna 1 ml av medium från plattan.
- Tillsätt 3 ml färskt cellodlingsmedier (från 15 ml koniskt rör) till plattan.
- Utför ytterligare två tvättningar, varje gång långsamt bort 3 ml lösning från plattan och tillsats 3 ml färskt cellodlingsmedier.
- Cellerna bör nu vara i 4 ml cellodlingsmedium och innehåller Fluo4-AM. Fluo4-AM är enzymatiskt klyvs en gång inne i cellen, hindrar den från att diffundera ut ur cellen eller i någon membranbundna fack. Innan du lägger plåten på scenen av konfokala mikroskop för avbildning, rita en vertikal röd linje med märkpenna på skålen samtidigt locket på för att förhindra markör partiklar från att förorena kulturen. Den vertikala linje dras ned sidan av petriskålen (bas petriskålen, inte locket). Dess syfte är att indikera orienteringen av odlingsplattan med avseende på synfältet, så att den exakta orienteringen och inriktningen av de enskilda cellerna kunde återupprättas vid en senare tidpunkt.
- Plattan är nu redo för lastning på stadium av konfokala mikroskop för avbildning. Visualisera de celler med hjälp av ljusa fält inställningar på en laserskanning konfokalmikroskop (mål 20X). Hitta ett område med täta celler som inte innehåller klumpar, helst med ett synfält som innehåller det stora nätet siffrorna på Cellatice täckglaset att göra hitta samma synfält lättare senare när avbildning kulturen efter i siTU hybridisering. Före bildåtergivning, fokus nedåt genom kulturen och ta en ljus fält bild av gallret nedanför cellerna att registrera läget och orienteringen av cellodlingen. Detta medger justering av cellerna för efterföljande analys.
- Höj fokalplanet och fånga en ljus fält bild av cellerna innan du börjar kalcium avbildning (Figur 3A).
- När centrumplanet av cellerna är i fokus, är plattan klar för avbildning av kalcium aktivitet. Inställningar kommer att variera beroende på mikroskopet och ansökan. Vi bild cellerna med användning av en Argon 488 nm laser för 1, 2, eller 12 timmar med följande parametrar:
- 1 tim bilder:
- Argon 488 nm laser skannas på 4% av sin maximala 30 MW.
- Skanna gång 4 sek (900 scanningar per timme).
- 2 tim bilder:
- Argon 488 nm laser skannas på 4% av sin maximala 30 MW.
- Scan gång8 sek (450 scanningar per timme).
- 12 tim bilder:
- Argon 488 nm laser scannar till 2% av sin maximala 30 MW.
- Skanna en gång 48 sek (75 scanningar per timme).
- 1 tim bilder:
Dessa parametrar kommer att resultera i en uppsättning av 900 stillbild bilder för varje tidsram. Kalcium aktivitet kan sedan registreras genom att analysera fluorescens nivåer över bilderna tidsförloppsdata (Figur 3B) med hjälp av en bildbehandling program som ImageJ 50.
4. Fastställande celler
- Efter avbildning kan celler fastställas för 30 minuter genom att ta bort 3 ml lösning från plattan och tillsätta 1 ml 2X MEMFA till de återstående 1 ml odlingsmedium.
- Efter fixering, bort MEMFA och torka celler med en serie av 5 min tvättar, vardera en volym av 1 ml:
- 25% etanol i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- 50% etanol i 1 x PBS. <li> 75% etanol i sdd H 2 O (sterilt avjoniserat destillerat vatten).
- Ersätt sista tvättningen med 1 ml 100% etanol och lagra platta vid -20 ° C.
Obs: Metanol kan även användas för dessa tvättar och för lagring.
5. Fluorescent in situ hybridisering (FISH)
Kulturer kan analyseras med hjälp av standardformuläret FISH protokollet för Xenopus enligt beskrivningen 51 med modifieringar för cellodling som beskrivs av Anderson Lab 52. Ändringar av Anderson Lab protokollet listas nedan. Alla tvättar utförs på de 35 plattorna mm Nunclon i volymer om cirka 1 ml, om inte annat anges. Lösningar är såsom definierats i Sive et al. Inget annat anges 53.
Viktigt: Använd inte fluoresceinmärkt RNA-prober när du utför in situ hybridisering på celler avbildas ikalcium aktivitet. Anti-fluorescein-antikroppar kommer att binda till resterande Fluo4-AM i cellerna och kan orsaka positiv signal i alla celler i kulturen.
Dag 1: permeabilisering och hybridisering
- Rehydrering tvättar bör graderas på uttorkning lösningsmedel som används för lagring. För våra experiment tvättar graderade till etanol i 1X PBS.
- Efter rehydratisering, tvätta cellerna ytterligare tre gånger i 1 x PBS under 5 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Blanda 25 ml av 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) med 62,5 pl av ättiksyraanhydrid i ett Falcon-rör och snabbt blanda tills ordentligt dispergerad som diskuteras i Anderson Lab 52 protokoll. Inkubera kulturer i denna blandning under 10 minuter vid rumstemperatur. Efter ättiksyraanhydrid behandling, tvätta cellerna i 1X saltlösning natriumcitrat (SSC) under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort den sista SSC tvätt och ersätt med 0,2 M HCl (i SDD H2O) i 10 min för att permeabilisering celler. </ Li>
- Skölj HCl med två tvättar i 1 x PBS under 5 minuter.
- Prehybridize i ISH buffert vid 60 ° C i ett skakande vattenbad under minst 6 timmar, men inte prehybridize natt som denna allvarligt minskar signal.
- Hybridiserar över natten vid 60 ° C under 8-14 h i 750 pl utspädd prob (1:250 utspädning från en renad sond). Den renade varierar probkoncentration 1,0 till 1,5 pg / pl.
Dag 2: Borttagning av Obundet sond och antikroppar Inkubation
- Avlägsna sonden och skölj kulturer under 5 min i 0,2 X SSC vid 60 ° C. Tvätta i färsk 0,2 X SSC under 1 timme vid 60 ° C.
- Ta kulturer från vattenbadet och låt dem att anpassa sig till rumstemperatur under 5 minuter.
- Skölj i 0,2 X SSC vid rumstemperatur under 5 min.
- Tvätta under 15 min i 1 x PBS med 0,1% Triton-X-100 (PBT).
- Att inaktivera endogena peroxidaser, tvätta under 1 h i en 2% H 2 O 2-lösning i PBT.
- Block i 2% Blocking Reagent i Maleinsyra buffert (MAB) under 1 timme vid rumstemperatur. Vi har funnit att denna blockerande metod ökar känsligheten i jämförelse med tidigare metoder för blockering i 20% fårserum i PBT.
- Inkubera kulturer i 1 ml 2% Blocking Reagent i MAB innehållande en 1:1000 utspädning av en POD-konjugerad antikropp över natten vid 4 ° C.
Dag 3: Borttagning av obunden antikropp och fluorescens utveckling
- Avlägsna antikroppslösning och skölj 3 gånger i TBST under 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta 4 gånger i TBST under 15 min vid rumstemperatur under kontinuerlig gungande med en långsam hastighet.
- Tvätta två gånger i PBT vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Applicera 750 pl 1:200 fluorescein-tyramid eller 1:25 Cy3 tyramid utspädd i PBT. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och tillsätt 2,5 | il 0,3% H 2 2. Rock under 40 min för att tillåta signalen att utvecklas.
- Tvätta minst 4 gånger under 15 minuter vardera i TBST vid rumstemperatur med skakning.
- När signalen har fullt utvecklat, tvätta i 5 minuter i 1 x PBT.
- Fix i 1X MEMFA under 1 timme vid rumstemperatur och lagra i 1 x PBS vid 4 ° C.
6. Bild FISK Resultat och Co-register med kalcium Data Imaging
- Efter avslutad fisk, cell odlingsplattor avbildas för att avgöra vilka celler uppvisar en positiv fluorescenssignal för en given sond. Använd Cellattice täckglaset för att hitta den exakta synfält studerats under kalcium avbildning och anpassa plattan till orienteringen av ramarna kalcium bild.
- Fokus på mittplan cellerna och ta en högupplöst bild med helium-neon HeNe 543 nm laser vid 15% av sin maximala 1 mW effekt (figur 3C).
- I den ursprungliga 900 ram uppsättning bilder tagna från Calcium Imaging protokollet,identifiera enskilda celler som regioner av intresse (ROI) genom användning av ett bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ 50). Utdrag ROI fluorescensdata som en uppsättning datapunkter som representerar tiden fluorescens par värden (Figur 4).
- Överlagra FISH resultat bilden med den identifierade ROI från kalcium bilder (Figur 3D).
- Registrera varje ROI som positiv för sonden, negativa för sonden, eller okända - i det fall att cellen motsvarar ROI kan inte längre finns inom synfältet för FISH bilden.
- Process ROI fluorescens data med statistisk analys skript (som utformats genom MATLAB eller annat programmeringsspråk) för att jämföra kalciumnivåer aktivitet bland olika dissekerade steg (figur 5A och 5C) eller celler positiva för olika fiskar prober (figur 5B och 5D). Alla skript som används i vårt labb är fritt tillgängliga på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på framgångsrikt dissekerade optiska vesiklar (steg 25) och retinae (steg 35) visas i figurerna 2E och 2J. Även detta protokoll kan användas i olika stadier av utveckling, är det viktigt att erhålla endast näthinnevävnad att säkerställa noggrannheten för ytterligare experiment. Ta försiktigt bort epidermis i alla led och se till att dina pincett inte punktera näthinnevävnad. I steg 35 eller äldre, kan linsen ses som ett klart skikt ovanpå näthinnan och kan avlägsnas genom försiktig skrapning med pincett.
En framgångsrikt pläterad primär cellodling visas i figur 3A. När dissociation vävnad, är det viktigt att inte lämna näthinnans explantatet i sköljlösningen längre än den rekommenderade 30 sek inkubationstid för att förhindra att vävnad från dissocieras i skölj lösningen. Dessutom se till att vävnaden får dissociera i trypsin lösningen för en hel timme(Äldre embryonal och larvstadium kan kräva ännu längre) för att möjliggöra en jämn fördelning av celler i odlingsplattan. När cellerna är pläterade, försiktig när du flyttar plattan och byta lösningar för att undvika att tvätta cellerna från plattan.
Figurerna 3B och 3C visar bilder från kalcium aktivitet skanning och fluorescerande in situ hybridisering experiment (FISH), respektive. Celler som visas ljust grönt i bilden kalcium är celler som genomgår en övergående stegring i intracellulära kalciumnivåer som ett resultat av frisättningen av internt kalcium butiker. Celler kan därefter analyseras för genuttryck med användning FISK, och genuttryck mönster kan korreleras till mönster av kalcium standardtillsatser aktivitet genom att överlagra bilderna (figur 3D). Med en kombination av Python och MATLAB-skript (fritt tillgänglig på begäran), data som erhållits genom att analysera fluorescens aktivitet varje individuelltal regionen av intresse (ROI) genom loppet av avbildning. Ett exempel på kalcium aktiviteten för en enskild cell (ROI) över 1 timme av avbildning visas i figur 4, en spik är synlig vid ungefär 57 minuter för bildframställning. I tabell 1 är representativa data för andelen celler positiva för olika sonder visas, medan det inte finns några uppgifter som är specifika för detta experiment rapporterats i litteraturen (punkten av våra nuvarande experiment är att bestämma dessa procentsatser), våra resultat överensstämmer med data från liknande typer av försök avseende kalcium aktivitet i ryggmärgen 17,55,56.
Parametrar som används för analysen innefatta antal, frekvens och amplitud spikar. Figur 5 ger representativa resultat av kalcium avbildning och experiment Fisk i embryonala retinala celler med hjälp av prober för xVglut1, Ptf1a och xGAD67. Med hjälp av MATLAB-skript, antalet spikar för EACh ROI bestämmes och antalet spikar är medelvärdet för alla ROI i experimentet. Det genomsnittliga antalet spikar från varje experiment kan sedan sammanställas med andra experiment, vilket resulterar i genomsnittet för en grupp av experiment. Kumulativ fördelning tomter kan skapas för att visa fördelningen av det genomsnittliga antalet spikar för alla experiment inom en grupp. MATLAB-skript används sedan för statistisk analys av data.
Figur 5 visar representativa data efter MATLAB-analys. Kortfattat, våra resultat visar att kalcium aktivitet utvecklingsmässigt är reglerad, med spetsning topp vid steg 35 (p <0,002) (figur 5A och 5C). När det gäller korrelera kalcium aktivitet med celler positiva för en viss sond, medan det inte fanns några statistiskt signifikanta skillnader, men det var en trend (p = 0,08) för celler positiva för xGAD67 (en markör för differentierade GABAerga celler) för att visa highe r nivåer av kalcium standardtillsatser aktivitet än celler positiva för en glutamaterg markör eller för Ptf1a, en gen som kodar en gen transkriptionsfaktor korrelerade med främja GABAeric fenotypen. Även preliminära, tyder dessa data på att det kan finnas GABAergic celler, som utvecklas på ett sätt som är oberoende av Ptf1a eller verksamheten beroende neurotransmittorn specifikation inte agerar på samma nivå som Ptf1a.
Figur 1. Protokollsida schematisk. Snart näthinnevävnad dissekeras och dissocieras, primär cellodling kan användas för en mängd olika tillämpningar.
s.jpg "/>
Figur 2. Dissekering fotografier. Embryon färgades i Nile Blue Sulfate för ökad kontrast. AE: Steg 24. FJ: Steg 35. Förkortningar:. OV, optisk vesikel, fb, framhjärnan, SC, ryggmärg, mig, mesoderm, så, somiter, le, lins, cg, cement körtel, re, näthinnan, EP, epitel Klicka här för större bild .
Figur 3. Bilder från cellodling med ROI inringat. A. Ljusfält. B. Bild efter Fluo-4 (AM) behandling med ROI inringat. C. FISH bild (pilar indikerar exempel på celler positiva för alfa-subenheten av den spänningsstyrda kalciumkanalen CaV2.1). D. Överlagring av ljust fält, Fluo-4 och bilder Fish.
7/4377fig4.jpg "alt =" Bild 4 "fo: content-width =" 3.5 tum "FO: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Exempel på kalcium aktivitet för en enskild cell (ROI). Diagram av fluorescens (i relativa fluorescensenheter, RFU) mot tid (i minuter) från en Fluo4 kalcium fluorescens bild.
Figur 5. Resultat visar kalcium tillsatta för steg och sond. A. Genomsnittligt antal kalcium spikar i stegen 30 (n = 4), 35 (n = 8), och 38 (n = 13). B. Genomsnittligt antal kalcium spikar per kultur bland olika prober som används för in situ hybridisering i steg 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3) och Ptf1a (n = 4). C. Kumulativ fördelning tomt på det genomsnittliga antalet spikar per kulturen på stegen 30, 35, 38. D. Kumulativ DISTRIBUTIpå tomt på det genomsnittliga antalet spikar per kultur för celler som kan anses ha en positiv signal för in situ hybridiseringsprober i etapp 35,. xVglut1, xGAD67 och Ptf1a Klicka här för större bild .
| Probe | Steg | n (plattor) | n (celler) | Procent Positiv |
| xGAD67 | 35 | 4 | 1042 | 2% |
| 38 | 4 | 690 | 2% | |
| Ptf1a | 30 | 3 | 352 | 1% |
| 35 | 6 | 1856 | 1% | |
| xVglut1 | 30 | 1 | 47 | 57% |
| 35 | 3 | 692 | 2% | |
| 38 | 3 | 364 | 4% | |
Tabell 1. Procent positiva celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med sina välkarakteriserade celltyper som är konserverade i alla ryggradsdjur, ger näthinnan en användbar modell för att studera molekylär cellulära processer som styr specifikation celltyp och differentiering. Primär cellkultur ger en kraftfull metod för att undersöka ett stort antal processer, inklusive genexpression, dynamik protein och kalcium och elektrisk aktivitet vid nivån för en enda cell upplösning. Här presenterar vi en enkel teknik för primär cellodling från dissekerade presumtiva näthinnevävnad i Xenopus laevis, ett särskilt mottaglig organism för sådana studier eftersom presumtiva näthinnan är lättillgängligt från de allra tidigaste stadierna av utveckling och att det primära cellodling kan uppstå i en definierade medier bestående av en enkel saltlösning.
Även lätt att anpassa till de flesta laboratoriemiljö, det finns flera steg som kräver särskild uppmärksamhet. Dissections bör utföras med nyligen skärpta pincett. Yngre steg (<st. 30) nytta av behandling med kollagenas B blandas med cellodlingsmediet. Alla steg som innebär överföring av vävnader eller celler från ett medium till ett annat måste utföras med särskild omsorg för att förhindra att vävnad eller celler från att komma in i närheten av luft-lösningen gränssnitt. Pipetten innehåller vävnaden bör vara helt nedsänkt i massor av vätska och celler eller vävnader utvisas mycket långsamt. Efter att cellerna har pläterade,, alla vätskenivåer överföringar inklusive Fluo4-AM tillägg och cellodlingsmedium eller tvättar fixering måste noggrant genomföras med tanke på att celler lätt kan rubbas. Som med alla cellodling, är sterilitet oro, så försiktighet bör vidtas för att sterilisera alla material. Slutligen, låta de dissocierade retinala explantaten sitta för utsedda tidsramen på dissociation mediet är avgörande för framgångsrik cellvidhäftning och för att undvika klumpar.
Underdissektion och kultur tillstånd som beskrivs i detta protokoll, både nekros och apoptos är mycket begränsade (mindre än 5-10% av cellerna). Förlust av celler på plattan (apoptos) är sällan upptäcks under före och efter konfokala imaging sessioner. Hantering cellkulturer noggrant är nyckeln till cellviabiliteten. Lösning ändringar måste göras mycket långsamt och stadigt för att förhindra cell nekros och apoptos. Även försök att beskriva den exakta förhållandet mellan näthinnan celltyper pågår för närvarande, vi notera att en rad retinala celltyper verkar vara representerade i de kulturer och att Muller gliaceller (som har en tydlig morfologi) är inte dominerande i de kulturer .
En potentiell oro vid analys plattorna efter in situ hybridisering experiment är att vissa av cellerna kan ha flyttats, men detta kan åtgärdas med hjälp av program cell spårning. Dessutom, inneboende i tekniken för primär cellkultur, är en stor begränsning: ee uppenbar förlust av rumslig mönstring som är närvarande i intakt vävnad. Identiteten hos enskilda celler måste fastställas med molekylära analyser snarare än plats i vävnaden. Ger dock denna funktion också möjlighet att analysera tillståndet i specifikationen av celler mycket exakt och i avsaknad av fortsatta cell-cell interaktioner. Det möjliggör också utredaren att selektivt behandla cellerna med tillväxtfaktorer eller andra föreningar och exakt analysera effekterna utan påverkan av signaler från angränsande celler. Medan vi har anställt denna retinal dissektion och primär cellkultur teknik för att korrelera kalcium avbildning med specifika markörer neurotransmittorer fenotyp, är denna teknik anpassas till ett stort antal andra nedströms tillämpningar, inklusive elektrofysiologiska inspelningar och encelliga gen analyser uttryck med RT-PCR eller "nästa -gen "transkriptom analys (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar nådigt Dr John Hayes för skript, Dr. Eric Bradley och Christopher Del Negro för hjälp med konfokalmikroskopi, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, och Liz MacMurray för deras arbete med att utveckla projektet och ge preliminära data, Dr Greg Smith för bra tips på statistisk analys. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag (NINDS IR15N5067566-01) till MSS och en Howard Hughes Medical Institute Science Education Bidrag till College of William and Mary.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||||||
| For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
| BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
| Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
| 35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
| Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
| Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
| Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
| Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
| Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
| Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
| Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
| 500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
| For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
| Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
| Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
| LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
| For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
| Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
| Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
| NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
| Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
| Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
||||||||||||||||||||||||
Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |
||||||||||||||||||||||||
References
- Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
- Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
- Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
- Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
- Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
- Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
- Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
- Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
- Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
- Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110 (2007).
- Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
- Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
- Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
- Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
- Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
- Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
- Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
- Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
- Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940 (2004).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
- Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
- Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
- Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
- Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
- Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
- Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
- Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
- Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
- Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
- Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
- Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
- Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
- Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
- Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11 (2008).
- Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
- In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
- Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
- Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259 (2011).
