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Neuroscience

Dissezione, Cultura, e analisi di doi: 10.3791/4377 Published: December 23, 2012
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Abstract

Il processo attraverso il quale la regione anteriore della piastra neurale dà luogo alla retina dei vertebrati continua ad essere uno degli obiettivi principali della ricerca, sia clinica e di base. Oltre alla ovvia rilevanza medica per capire e trattare malattie retiniche, lo sviluppo della retina dei vertebrati continua a servire come sistema modello importante ed elegante per la determinazione neuronale tipo comprensione e differenziazione 1-16. La retina neurale si compone di sei tipi di cellule discrete (ganglio, fotorecettori amacrine, orizzontale,, cellule bipolari e cellule gliali Müller) disposte a strati stereotipati, un modello che è in gran parte conservata tra tutti i vertebrati 12,14-18.

Mentre studiava la retina di un embrione in via di sviluppo è chiaramente intatta necessario per capire come questo organo complesso si sviluppa da una sporgenza del prosencefalo in una struttura a strati, ci sono molte domande che beneficiano from impiegando approcci utilizzando colture primarie di cellule presunte cellule retiniche 7,19-23. Ad esempio, analizzando le cellule da tessuti rimossi e dissociati in diverse fasi permette di distinguere lo stato di specificazione di singole cellule a diversi stadi di sviluppo, cioè, il destino delle cellule in assenza di interazioni con i tessuti vicini 8,19-22 ,24-33. Coltura cellulare primaria permette anche al ricercatore di trattare la cultura con reagenti specifici e analizzare i risultati a livello di singola cellula 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un sistema classico modello per lo studio dei prime fasi dello sviluppo neurale 19,27,29,31-32,40-42, serve come un sistema particolarmente adatto per coltura di cellule della retina primario 10,38,43-45.

Presunto tessuto retinico è accessibile sin dalle prime fasi di sviluppo, subito dopo l'induzione neurale 25,38,43. Inoltre, dato thad ogni cellula nell'embrione contiene una fornitura di tuorlo, cellule retiniche possono essere coltivate in un mezzo molto semplici definiti costituiti da una soluzione salina tamponata, eliminando così gli effetti confondenti di incubazione o altri prodotti a base di sieri 10,24,44-45 .

Tuttavia, l'isolamento del tessuto retinico dai tessuti circostanti e la successiva elaborazione è impegnativo. Qui, presentiamo un metodo per la dissezione e la dissociazione di cellule retiniche in Xenopus laevis che verranno utilizzati per preparare colture cellulari primarie che, a sua volta, essere analizzati per attività di calcio e l'espressione genica a risoluzione di singole cellule. Mentre l'argomento presentato in questo documento è l'analisi di transienti di calcio spontanee, la tecnica è ampiamente applicabile ad una vasta gamma di domande di ricerca e approcci (Figura 1).

Protocol

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Tutti gli esperimenti sono effettuati sulla base di protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso presso il College of William and Mary. Stadi di sviluppo fa riferimento in questo protocollo sono secondo Nieuwkoop e Faber 46.

1. Dissezione

  1. Lasciare che il mezzo di coltura cellulare e Magnesio Media Calcio Gratis (CMF) a temperatura ambiente. Avrete anche bisogno di 0,1 X. Marc modificato Ringer (MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Sterilizzare i seguenti applicando una luce UV per 30 min in una cappa cella a flusso laminare cultura. (Spruzzare ogni elemento con il 70% di etanolo prima di mettere nella cappa.)
    • 35 millimetri Petri di plastica.
    • 60 millimetri Petri di plastica.
    • 35 millimetri di superficie Nunclon piatti.
    • 1,5 ml microcentrifuga tubi.
    • p1000 micropipetta (1.000 micropipetta pl).
    • Aerosol resistenti p1000 consigli (1000 ul consigli aerosol micropipette resistenti).
    • Alcoolpenna resistente.
    • Bene dissezione pinza.
    • * 15 ml provette coniche (solo per l'attività di imaging di calcio).
    • * Solo per l'imaging di attività calcio.
  3. Una volta che il cappuccio è stato sterilizzato ai raggi UV e le soluzioni hanno riportati a temperatura ambiente, attivare il flusso d'aria laminare nella cappa, spruzzare guanti e bottiglie di media con il 70% di etanolo e di altri supporti posto bottiglie nella cappa.
  4. All'interno della cappa preparare la seguente con una micropipetta p1000 per ciascuna piastra di cellule, assicurando un'adeguata etichettatura.
    • Una antenna di 60 mm plastica Petri contenente 10 ml cellulare Medio Cultura - Tavola Dissection.
    • Una superficie di 35 millimetri piatto Nunclon contenente 2 Cella Medio ml Cultura - piastra di coltura. (Nunclon piatti di plastica non sono trattati con collanti.)
    • Un vuoto da 1,5 ml microcentrifuga tubo-Espianto dissociazione Tube.
    • * Un 15 ml conica falcoprovetta contenente 15 ml cellulare Medio Cultura. Per il lavaggio in eccesso Fluo4-AM in cui l'attività di calcio di imaging.
  5. All'interno della cappa, preparare il seguente con una micropipetta p1000 per ogni sessione dissezione (più di una retina può essere sezionato in una sessione).
    • Un piatto di plastica 35 millimetri Petri contenente 2 ml di CMF - Espianto Sciacquare Plate.
    • Un piatto di plastica 35 millimetri Petri contenente 2 ml di CMF - Espianto Tavola dissociazione.
  6. All'esterno della cappa preparare la seguente:
    • Un piatto di plastica 60 millimetri Petri per piastra di cellule contenenti 10 ml di 0,1 X. MMR - Tenendo Plate.
    • Un piatto di plastica 60 millimetri Petri per piastra di cellule contenenti 10 ml di 0,1 X. MMR - Tavola Sibling.
    • Un piatto di plastica 60 millimetri Petri per sessione dissezione contenente 10 ml di 0,1 X. MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaine) - Tavola anestesia.
  7. Piastra Espianto di dissociazione (per ottenere una soluzione di tripsina 0,1%), agitare, e mettere da parte.
  8. Se dissezione un embrione che è più giovane di fase 30, aggiungere 10 mg Collagenasi B alla piastra Dissection (con conseguente mg / ml soluzione 1 Collagenasi B), agitare per sciogliere e mettere da parte.
  9. Selezionare un embrione della fase desiderata, trasferire la piastra con un non-sterile pipetta di trasferimento, e rimuovere la membrana vitellina (se l'embrione non è ancora tratteggiata) con una pinza sottile.
  10. Trasferire più embrioni in scena in modo identico alla piastra con un elemento di pari livello non sterile pipetta di trasferimento.
  11. Se l'embrione è stadio 25 o precedente, procedere direttamente con dissezione, altrimenti trasferire l'embrione alla piastra con un anestesia non sterile pipetta di trasferimento e consentire l'embrione di sedersi fino a quando il movimento e la risposta agli stimoli cessa. Questo potrebbe richiederefino a un minuto.
  12. Procedere con dissezione (Figura 2) in un ambito di dissezione (obiettivo 4X, oculare 10X).

Per la fase embrioni 25 o più giovani:

  1. Trasferimento di embrioni per la piastra di dissezione con un non-sterile pipetta di trasferimento.
  2. Utilizzando due coppie di pinze sottili, fare un taglio mediosagittale sul lato ventrale dell'embrione, a partire dalla estremità posteriore e continuando attraverso la ghiandola cemento nella porzione anteriore dell'embrione.
  3. Attentamente aprire l'embrione afferrando entrambi i bordi del taglio e la diffusione sinistra e destra. Ciò si traduce in un embrione con il lato dorsale rivolta verso la piastra dissezione, e con l'ectoderma ventrale divaricate a rivelare l'endoderma e mesoderma all'interno.
  4. Iniziare a rimuovere l'endoderma e mesoderma (Figura 2A e 2B). Il primo strato e più grande di questo tessuto è molto "soffice" in apparenza concellule di grandi dimensioni e poco evidente organizzazione.
  5. Dopo aver rimosso questo strato, la notocorda somiti e diventerà visibile. Per contrasto migliore, spostare l'embrione in un piatto di plastica separato 60 millimetri Petri contenenti 10 ml cultura cellulare medio e 100 pl di soluzione di 1% di solfato Nile Blue (in acqua) per 2-3 minuti prima di trasferire torna alla piastra Dissection. Questo si macchia l'ectoderma, somiti, notocorda e per facilitarne l'identificazione e l'orientamento.
  6. Concentrandosi sulla porzione anteriore dell'embrione, rimuovere con attenzione la notocorda e qualsiasi mesoderma rimanente esponendo il cervello e vescicole ottiche (Figura 2C).
  7. Una volta che il cervello e vescicole ottiche sono completamente esposti, utilizzare le pinze per tagliare il tubo neurale e ectoderma sottostante appena posteriormente al cervello.
  8. Ruotare questa parte (il cervello e vescicole ottiche) in modo che il ectoderma è in cima.
  9. Facendo attenzione a non danneggiare le vescicole ottiche sottostanti, accuratamente rispostare l'ectoderma (Figura 2D).
  10. Infine, l'uso di pinze, separare le vescicole ottiche dal cervello (Figura 2D e 2E).

Per gli embrioni più vecchi di tappa 25:

  1. Mentre l'embrione è in tavola anestesia, rimuovere la parte ventrale dell'embrione con una pinza.
  2. Per una migliore contrasto, spostare l'embrione di un piatto di plastica 60 millimetri Petri contenente 10 ml 0,1 X. MMR e 100 ml di 1% solfato Nilo Azzurro per 2-3 minuti prima di trasferire alla piastra Dissection. Questo si macchia l'azzurro ectoderma.
  3. Una volta nel piatto dissezione, tirare indietro l'ectoderma sovrastante la retina (o vescicola ottica per la fase embrioni 26-30) (Figura 2F e 2G). Se Nilo Azzurro Solfato è stato utilizzato, l'ectoderma saranno colorati blu, ma il tessuto di fondo della retina non lo faranno.
  4. Rimuovere la retina o vescicola ottica accuratamente con forceps (Figura 2H, 2I e 2J). E 'utile tenere l'embrione in posizione con un paio di pinze e rimuovere la retina o vescicola ottica con l'altro.

2. Dissociazione di tessuti e di cellule placcatura

Nota importante - Durante il trasferimento di tessuti, non consentono la retina o vescicola ottica per toccare i confini aria-liquido, se questo si verifica le cellule lisi.

  1. Una volta che la vescicola ottica o della retina è stato sezionato con cura il trasferimento al Espianto Risciacquare piatto con una micropipetta p100 con aerosol punte resistenti e lasciar riposare per 30 sec.
  2. Trasferire 80 ml ​​di 0,1% tripsina nel CMF dalla piastra Espianto dissociazione alla metropolitana Espianto dissociazione.
  3. Con una micropipetta P100 e aerosol punte resistenti, trasferire la retina o vescicola ottica dal Espianto Sciacquare piastra al Dissociati Espiantoil tubo, evitando il trasferimento degli espianti soluzione di risciacquo.
  4. Permettono il tessuto di dissociare in tubo Espianto dissociazione per 1 ora a temperatura ambiente. Una retina è stata utilizzata per piastra, tuttavia si nota che è possibile utilizzare più di una piastra per se lo si desidera aumentare il numero di cellule per piastra.
  5. Per piastra le cellule, prima lentamente prelevare 40 ml di soluzione dalla metropolitana Espianto Dissociazione e scartare con una micropipetta P100 e aerosol punte resistenti. Utilizzo di un p100 impostato a 40 microlitri e aerosol punte resistenti, trasferire le cellule (ora che il tessuto si è dissociata) alla piastra di coltura. Quando le cellule aspirazione sulla piastra, pipettare lentamente e mantenere le cellule in una piccola area al centro della piastra.

Nota: Se più immagini delle cellule devono essere prese durante l'esperimento, collegare una griglia (Cellattice) alla parte inferiore della piastra di coltura

  1. Permettono alle cellule di riposare per almeno 1 ora di aderire alla piastra Nunclon. Trascorso questo tempo, devono essere trattati con estrema delicatezza o potrebbero staccarsi.
  2. Cultura cellule a stadio desiderato osservando gli embrioni di pari livello, che vengono allevati alla stessa temperatura come le cellule. Se le cellule vive non vengono utilizzati per ulteriori manipolazioni, possono essere fissati in soluzione MEMFA in questo momento.

Nota importante: la maggior parte dei nostri esperimenti sono fissati entro 6 ore di placcatura cellule. La longevità delle cellule in coltura dipende la fase in cui il tessuto è stato dissezionato e la quantità di tuorlo ancora presente nelle cellule, cellule dissezionati da giovane (stadi neurula) rimanere sano in coltura per 5-6 giorni, mentre le cellule acquisita anziani embrioni (nuoto girinofasi) rimarrà valida in coltura per 2-3 giorni.

3. Calcio Imaging 47-49

Questo protocollo utilizza calcio-sensitive Fluo4 microscopia confocale-AM e quantificare transienti di calcio in cellule singole. Tutte le fasi che utilizzano Fluo4-AM deve essere eseguita al riparo dalla luce, come Fluo4-AM è sensibile alla luce. Tutti i lavaggi devono essere aggiunti o rimossi con una micropipetta P1000 e aerosol resistenti punte. Pipettare fatto lentamente e verso il bordo della lastra per non disturbare le cellule. Il supporto non è cambiato perché le culture sono generalmente fissati entro 6 ore di essere sezionato. Per il lungo termine le culture, i media dovrebbero essere cambiata ogni giorno.

  1. Fluo4-AM è conservato a -20 ° C, e si consiglia di conservare in aliquote di 5 pl. Prima di utilizzare, scongelare Un'aliquota di 5 ml di Fluo4-AM al riparo dalla luce e aggiungere 2 ml di Pluronic F-127 direttamente a questa aliquota.
  2. Dopo la coltura delle cellule per la quantità di tempo desiderato (almeno1 ora), rimuovere 1 ml di mezzo di coltura cellulare dalla piastra di coltura. Aggiungi questo alla Fluo4-AM e Pluronic, mescolando pipettando gentile.
  3. Lentamente trasferire tutta la soluzione di nuovo al bordo della piastra di coltura delle cellule di essere ripreso e lasciare le cellule in questa soluzione indisturbata per 1 ora per assorbire l'Fluo4-AM.
  4. Per lavare eccesso Fluo4-AM dal mezzo di coltura cellulare, completare la seguente serie di lavaggio:
    • Rimuovere 1 ml di supporto dalla piastra.
    • Aggiungere 3 ml di mezzo fresco di coltura cellulare (dal tubo 15 ml conica) alla piastra.
    • Effettuare due lavaggi addizionali, ogni volta rimuovere lentamente 3 ml di soluzione dalla piastra e aggiungere 3 ml di mezzo fresco coltura cellulare.
  5. Le cellule dovrebbero ora essere in 4 ml di mezzo di coltura cellulare e contengono Fluo4-AM. Fluo4-AM è enzimaticamente una volta all'interno della cellula, impedendole di diffondere fuori della cella o in eventuali vani legato alla membrana. Prima di caricare la piastra sul palco del microscopio confocale per l'imaging, tracciare una linea verticale rossa con pennarello indelebile sul piatto, mantenendo il coperchio per evitare che particelle marcatori di contaminare la cultura. La linea verticale viene prelevato il lato della piastra Petri (la base della piastra Petri, non il coperchio). Il suo scopo è quello di indicare l'orientamento della piastra di coltura rispetto al campo visivo in modo che l'orientamento preciso e allineamento delle singole celle potrebbe essere ripristinata in un momento successivo.
  6. La piastra è ora pronto per essere caricato sulla scena del microscopio confocale per l'imaging. Visualizza le celle utilizzando le impostazioni dei campi luminosi su un microscopio confocale a scansione laser (obiettivo 20X). Trovare una zona di cellule dense che non contiene ciuffi, preferibilmente con un campo visivo che contiene i numeri della griglia grandi sul coprioggetto Cellatice di rendere trovare lo stesso campo di vista più facile in seguito, quando la coltura dopo l'imaging in SItu ibridazione. Prima di imaging, concentrarsi giù attraverso la cultura e tenere un'immagine luminosa campo della griglia sotto le cellule per registrare la posizione e l'orientamento della coltura cellulare. Questo permette di riallineamento delle cellule per analisi successive.
  7. Sollevare il piano focale e catturare un'immagine luminosa campo delle cellule prima di iniziare calcium imaging (Figura 3A).
  8. Una volta che il piano centrale delle cellule è a fuoco, la lastra è pronta per l'imaging di attività calcio. Impostazioni variano a seconda del microscopio e l'applicazione. Abbiamo immagine le cellule utilizzando un laser 488 nm Argon per 1, 2, o 12 ore con i seguenti parametri:
    • 1 ora e immagini:
      • Argon laser 488 nm scansioni al 4% della sua potenza massima di 30 mW.
      • Scansione di una volta ogni 4 secondi (900 scansioni al hr).
    • 2h immagini:
      • Argon laser 488 nm scansioni al 4% della sua potenza massima di 30 mW.
      • Scansione una volta ogni8 sec (450 scansioni al hr).
    • 12 ore immagini:
      • Argon laser 488 nm scansioni al 2% della sua potenza massima di 30 mW.
      • Scansione di una volta ogni 48 sec (75 scansioni al hr).

Questi parametri si tradurrà in una serie di 900 immagini fisse telaio per ogni periodo di tempo. Attività calcio può essere registrata analizzando i livelli di fluorescenza più immagini Naturalmente il tempo (Figura 3B) con l'uso di un'applicazione di elaborazione delle immagini, come ImageJ 50.

4. Fissaggio Celle

  1. A seguito di imaging, le cellule possono essere fissate per 30 minuti rimuovendo 3 ml di soluzione dalla piastra e aggiungendo 1 ml 2X MEMFA al restante 1 ml di mezzo di coltura.
  2. Dopo il fissaggio, rimuovere MEMFA e disidratare cellule con una serie di 5 lavaggi min, ciascuno un volume di 1 ml:
    • 25% di etanolo in 1X tampone fosfato salino (PBS).
    • 50% di etanolo in 1X PBS.
    • <li etanolo> 75% in sdd H 2 O (acqua deionizzata sterile distillata).
    • Sostituire l'ultimo lavaggio con 1 ml di etanolo al 100% e la piastra di conservare a -20 ° C.

Nota: metanolo può essere utilizzato anche per questi lavaggi e per l'archiviazione.

5. Ibridazione in situ fluorescente (FISH)

Le culture possono essere analizzati utilizzando il protocollo standard per la FISH Xenopus come descritto 51 con le modifiche per colture cellulari, come indicato dal Laboratorio Anderson 52. Le modifiche al protocollo Lab Anderson sono elencati di seguito. Tutti i lavaggi vengono condotti su piastre da 35 mm Nunclon in volumi di circa 1 ml, se non diversamente specificato. Le soluzioni sono quelli definiti Sive et al 53. Se non diversamente specificato.

Nota importante: Non utilizzare marcato con fluoresceina sonde di RNA durante l'esecuzione di ibridazione in situ su cellule per creare immaginiattività calcio. Gli anticorpi anti-fluoresceina legherà Fluo4-AM residua nelle cellule e può causare segnale positivo in tutte le cellule in coltura.

1 ° giorno: Permeabilization e ibridazione

  1. Lavaggi reidratazione devono essere graduate al solvente utilizzato per la memorizzazione disidratazione. Per i nostri esperimenti, lavaggi sono stati spostati in etanolo in PBS 1X.
  2. Seguendo reidratazione, lavare le cellule per altre tre volte in 1X PBS per 5 minuti ciascuna a temperatura ambiente.
  3. Mescolare 25 ml di 0,1 M trietanolammina (pH 8,0) con 62,5 ml di anidride acetica in un tubo Falcon e rapidamente mescolare fino a completa dispersione come discusso nel Lab Anderson protocollo 52. Incubare culture in questa miscela per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente al trattamento anidride acetica, lavare le cellule in 1X sodio citrato salino (SSC) per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere l'ultimo lavaggio SSC e sostituire con 0,2 M HCl (SDD in H 2 O) per 10 min a permeabilize cellule. </ Li>
  5. Lavare HCl con due lavaggi in PBS 1X per 5 min.
  6. Prehybridize ISH in tampone a 60 ° C in un bagno d'acqua agitazione per almeno 6 ore, ma non prehybridize notte come questa diminuisce fortemente segnale.
  7. Ibridizzare overnight a 60 ° C per 8-14 ore in 750 pl di sonda diluito (diluizione 1:250 da una sonda purificato). La purificato intervalli di concentrazione sonda 1,0-1,5 ug / pl.

2 ° giorno: La rimozione della sonda non legate e incubazione dell'anticorpo

  1. Rimuovere la sonda e risciacquo culture per 5 min in 0,2 X SSC a 60 ° C. Lavare in acqua dolce 0,2 X SSC per 1 ora a 60 ° C.
  2. Rimuovere culture dal bagno di acqua e consentire loro di adattarsi alla temperatura ambiente per 5 min.
  3. Risciacquo in 0,2 X SSC a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Lavare per 15 minuti in 1X PBS con 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Per inattivare perossidasi endogene, lavare per 1 ora in un 2% H 2 O 2 in soluzione PBT.
  6. Bloccare in 2% Reagente Bloccante in tampone acido maleico (MAB) per 1 ora a temperatura ambiente. Abbiamo trovato che questo metodo di blocco aumenta la sensibilità rispetto ai metodi precedenti di blocco nel siero di pecora 20% in PBT.
  7. Incubare culture in 1 ml di reagente 2% in blocco MAB contenente una diluizione di 1:1000 un POD anticorpo coniugato notte a 4 ° C.

3 ° giorno: La rimozione di anticorpi non legati e lo sviluppo di fluorescenza

  1. Rimuovere soluzione di anticorpi e lavare 3 volte in TBST per 5 min a temperatura ambiente.
  2. Lavare 4 volte in TBST per 15 min a temperatura ambiente, durante il continuo oscillare a bassa velocità.
  3. Lavare due volte in PBT a temperatura ambiente per 10 min.
  4. Applicare 750 microlitri di 1:200 con fluoresceina o tiramide 01:25 Cy3 tiramide diluito in PBT. Incubare per 5 min a temperatura ambiente e aggiungere 2,5 microlitri 0,3% H 2 2. Rock per 40 minuti per permettere di sviluppare il segnale.
  5. Lavare almeno 4 volte per 15 minuti ciascuno in TBST a temperatura ambiente con oscillazione.
  6. Una volta che il segnale è completamente sviluppato, lavare per 5 minuti in 1X PBT.
  7. Fissare in 1X MEMFA per 1 ora a temperatura ambiente e conservare in 1X PBS a 4 ° C.

6. Risultati di immagini FISH e co-registrati con dati di immagini di calcio

  1. Al completamento della FISH, piastre di coltura di cellule vengono esposte per determinare le celle visualizzare un segnale positivo di fluorescenza per una sonda dato. Utilizzare il coprioggetto Cellattice per trovare esattamente il campo visivo studiato durante calcium imaging e allineare la piastra all'orientamento dei fotogrammi dell'immagine del calcio.
  2. Fuoco al piano centro delle celle e prendere una singola immagine ad alta risoluzione utilizzando il elio-neon HeNe 543 nm laser al 15% del suo massimo 1 mW di potenza (Figura 3C).
  3. Nell'originale cornice 900 serie di immagini prese dal protocollo di imaging di calcio,identificare le singole celle come regioni di interesse (ROI) attraverso l'uso di un programma di elaborazione di immagini (ad esempio ImageJ 50). Estrarre dati ROI fluorescenza come un insieme di punti di dati che rappresentano valori di fluorescenza time-pair (Figura 4).
  4. Sovrapporre l'immagine FISH risultati con le ROI identificato dalle immagini di calcio (Figura 3D).
  5. Registrare ogni ROI positivo per la sonda, negativa per la sonda, o sconosciuto - nel caso in cui la cella corrispondente alla ROI non può più essere trovato all'interno del campo di vista dell'immagine FISH.
  6. ROI di processo dati di fluorescenza utilizzando script di analisi statistica (come è stato concepito attraverso MATLAB o altro linguaggio di programmazione) per confrontare i livelli di attività di calcio tra le varie fasi di sezionato (Figura 5A e 5C) o le cellule positive per le sonde FISH diversi (Figura 5B e 5D). Tutti gli script utilizzati nel nostro laboratorio sono disponibili gratuitamente su richiesta.

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Representative Results

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Esempi di successo sezionati vescicole ottiche (fase 25) e retine (fase 35) sono mostrati nelle figure 2E e 2J. Mentre questo protocollo può essere utilizzato in diverse fasi di sviluppo, è fondamentale per ottenere solo tessuto retinico per assicurare la precisione per ulteriori esperimenti. Rimuovere con cura l'epidermide in tutte le fasi e garantire che i pinza non forare la retina. In fase di 35 anni o più, la lente può essere vista come uno strato trasparente sopra la retina e può essere rimosso mediante raschiatura prudente mediante pinza.

Una coltura cellulare primaria successo placcato è mostrata in Figura 3A. Quando dissociare tessuti, è importante non lasciare l'espianto retinica nella soluzione di risciacquo più a lungo del tempo di incubazione raccomandato 30 sec per impedire il tessuto da dissociare nella soluzione di risciacquo. Inoltre, garantire che il tessuto è permesso di dissociare la soluzione di tripsina per un'ora(Anziani embrionale e stadi larvali possono richiedere anche più a lungo) per consentire una distribuzione omogenea di cellule nella piastra di coltura. Una volta che le cellule sono placcati, prestare particolare attenzione quando si sposta il piatto e la modifica soluzioni per evitare di lavare le cellule dalla piastra.

Figure 3B e 3C dimostrare immagini da scansione calcio attività e fluorescenti in esperimenti di ibridazione in situ (FISH), rispettivamente. Cellule che sembrano verde brillante nell'immagine calcio sono cellule che stanno subendo un picco transitorio dei livelli di calcio intracellulare come conseguenza del rilascio di riserve di calcio interne. Cellule possono quindi essere analizzati per l'espressione genica mediante FISH, e modelli di espressione genica può essere correlata a schemi di attività calcio spiking con sovrapposizione delle immagini (Figura 3D). Usando una combinazione di script Python e MATLAB (liberamente disponibile su richiesta), i dati sono ottenuti analizzando l'attività di fluorescenza di ogni indivial regione di interesse (ROI) attraverso il corso di imaging. Un esempio di attività calcio per una singola cella (ROI) più 1 ora di immagini è mostrato nella figura 4; è visibile un picco a circa 57 min di imaging. In Tabella 1, i dati rappresentativi per la percentuale di cellule positive per varie sonde vengono mostrati, mentre non vi sono dati specifici per questo esperimento riportato in letteratura (punto di nostri esperimenti attuali è di determinare tali percentuali), i nostri risultati sono coerenti con dati provenienti da altri tipi di esperimenti relativi alle attività del calcio nel midollo spinale 17,55,56.

I parametri utilizzati per l'analisi sono il numero, la frequenza e l'ampiezza dei picchi. Figura 5 fornisce risultati rappresentativi di imaging di calcio e di esperimenti di FISH in cellule embrionali della retina mediante sonde per xVglut1, PTF1A e xGAD67. Utilizzando MATLAB script, il numero di punte per each ROI viene determinato il numero di picchi è la media per tutte le ROI nell'esperimento. Il numero medio di picchi di ciascun esperimento potrà essere compilato con altri esperimenti, determinando la media per un gruppo di esperimenti. Trame di distribuzione cumulativa può essere creato per visualizzare la distribuzione del numero medio di punte per tutti gli esperimenti di un gruppo. Script MATLAB vengono quindi utilizzati per l'analisi statistica dei dati.

La Figura 5 mostra i dati rappresentativi in seguito ad analisi MATLAB. In breve, i nostri risultati dimostrano che l'attività calcio è evolutivamente regolato, con un picco picchi nella fase 35 (p <0.002) (Figure 5A e 5C). In termini di correlazione tra attività di calcio con le cellule positive per una sonda specifica, mentre non vi erano differenze statisticamente significative, ma c'è stata una tendenza (p = 0,08) per le cellule positive per xGAD67 (un marker per le cellule differenziate GABAergici) per visualizzare highe r livelli di attività calcio spiking di cellule positive per un marcatore glutammatergica o per PTF1A, un gene codificante per un fattore di trascrizione gene correlato promuovere il fenotipo GABAeric. Anche se preliminari, questi dati suggeriscono che ci possono essere cellule GABAergiche, che si sviluppano in modo indipendente o che PTF1A-dipendente l'attività specifica neurotrasmettitore non agisce a livello di PTF1A.

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Figura 1. Schema procedurale. Una volta tessuto retinico è sezionato e dissociato, coltura cellulare primaria può essere utilizzato per una varietà di applicazioni.

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Figura 2. Fotografie Dissection. Embrioni sono stati colorati in solfato Nilo Azzurro per il contrasto aumentato. AE: Stage 24. FJ: Stage 35. Abbreviazioni:. Ov, vescicola ottica; fb, proencefalo, sc, midollo spinale, io, mesoderma, così, somiti, le, lente, cg, ghiandola del cemento, re, retina, ep, epitelio Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3
Figura 3. Immagini di coltura cellulare con ROI cerchiata. A. Campo luminoso. Immagine B. dopo Fluo-4 (AM), il trattamento con ROI cerchiato. C. immagine FISH (frecce indicano esempi di cellule positive per la subunità alfa del canale del calcio voltaggio gated CaV2.1). D. Sovrapposizione di campo chiaro, Fluo-4, e le immagini FISH.

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Figura 4. Esempio di attività calcio per una singola cella (ROI). Trama della fluorescenza (in unità di fluorescenza relativa, RFU) rispetto al tempo (in minuti) da un'immagine Fluo4 calcio fluorescenza.

Figura 5
Figura 5. Visualizzazione dei risultati spiking calcio dallo stadio e sonda. A. Numero medio di picchi di calcio a 30 stadi (n = 4), 35 (n = 8), e 38 (n = 13). B. numero medio dei picchi di calcio per coltura tra diverse sonde utilizzate per l'ibridazione in situ nella fase 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), e PTF1A (n = 4). C. trama distribuzione cumulativa del numero medio di punte per coltura nelle fasi 30, 35, 38. D. cumulativo DISTRIBUTIsu terreno di numero medio di punte per coltura per le cellule identificate come aventi un segnale positivo per l'in sonde di ibridazione in situ nella fase 35;. xVglut1, xGAD67 e PTF1A Clicca qui per ingrandire la figura .

Sonda Fase n (piastre) n (celle) Percentuale positiva
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
PTF1A 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

Tabella 1. Cellule per cento positivo.

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Discussion

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Con i suoi tipi di cellule ben caratterizzati che si conservano in tutti i vertebrati, la retina fornisce un modello utile per lo studio dei processi molecolari-cellulari che regolano tipo di specifica e la differenziazione cellulare. Coltura cellulare primaria offre un metodo potente per indagare un'ampia gamma di processi tra espressione genica, dinamica della proteina, e di calcio e attività elettrica a livello di singola cellula risoluzione. Qui vi presentiamo una tecnica semplice per colture cellulari primarie da tessuti sezionati presuntiva della retina di Xenopus laevis, un organismo particolarmente suscettibili per tali studi, dato che la retina in esame è facilmente raggiungibile dalle primissime fasi di sviluppo e che la coltura cellulare primaria può verificarsi in una mezzi definiti costituiti da una semplice soluzione salina.

Anche se facilmente adattabile alle maggior parte delle impostazioni di laboratorio, ci sono diversi passaggi che richiedono particolare attenzione. Dissecticomponenti deve essere eseguita con una pinza appena affilate. Stadi più giovani (<v. 30) beneficiano di un trattamento con collagenasi B miscelato con il mezzo di coltura cellulare. Tutte le fasi che riguardano il trasferimento di tessuto o di cellule da un supporto all'altro deve essere eseguito con particolare cura per evitare che il tessuto o le cellule entrino in prossimità della soluzione di interfaccia aria. La pipetta contenente il tessuto dovrebbe essere immersi completamente in abbondante fluido e le cellule o tessuti espulso molto lentamente. Dopo che le cellule sono state piastrate, inclusi tutti i trasferimenti fluidi, Fluo4-AM Inoltre, e terreno di coltura cellulare, o lavaggi fissaggio, deve essere eseguito con cura dato che le cellule possono essere facilmente sloggiato. Come per tutte le colture cellulari, la sterilità è preoccupazione, quindi occorre prestare attenzione per sterilizzare tutti i materiali. Infine, lasciando che gli espianti retinici dissociati sedere per il periodo di tempo indicato nel medio dissociazione è fondamentale per l'adesione delle cellule di successo e per evitare grumi.

Durantela condizione di dissezione e della cultura descritto in questo protocollo, sia la necrosi e l'apoptosi sono estremamente limitate (meno del 5-10% delle cellule). La perdita di cellule sulla piastra (apoptosi) è raramente notato durante il pre e post sessioni di imaging confocale. Gestione di colture cellulari con attenzione è la chiave per la vitalità cellulare. Modifiche Solution deve essere eseguita molto lentamente e costantemente per impedire necrosi cellulare e l'apoptosi. Mentre esperimenti per delineare il rapporto preciso di tipi di cellule retiniche sono attualmente in corso, si nota che una varietà di tipi di cellule retiniche sembrano essere rappresentati nelle culture e che cellule gliali Muller (che hanno una morfologia distinta) non sono dominanti nelle culture .

Un problema potenziale analizzando le piastre dopo esperimenti di ibridazione in situ è che alcune delle cellule può essere spostato, ma questo può essere affrontato con l'uso di programmi di monitoraggio delle cellule. Inoltre, inerente la tecnica di coltura cellulare primaria, una maggiore limitazione è the evidente perdita di patterning spaziale che è presente nel tessuto intatto. L'identità di singole celle devono essere stabiliti usando saggi molecolari piuttosto che dalla posizione nel tessuto. Tuttavia, questa funzione fornisce anche la possibilità di analizzare lo stato di specifica di cellule molto preciso ed in assenza di continue interazioni cellula-cellula. Inoltre permette al ricercatore di trattare selettivamente le cellule con fattori di crescita o altri composti e precisamente analizzare gli effetti senza l'influenza di segnali provenienti da cellule vicine. Anche se abbiamo impiegato questa dissezione della retina e primaria tecnica di coltura cellulare per la correlazione di immagini di calcio con i marcatori specifici fenotipo neurotrasmettitori, questa tecnica è adattabile ad una vasta gamma di altre applicazioni a valle tra cui registrazioni elettrofisiologiche e singole cellule saggi di espressione genica mediante RT-PCR o "successivo -gen "trascrittoma analisi (Figura 1).

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Abbiamo gentilmente Ringraziamo il Dott. John Hayes per gli script, Drs. Eric Bradley e Christopher Del Negro per l'assistenza con la microscopia confocale, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, e Liz MacMurray per il loro lavoro nello sviluppo del progetto e la fornitura di dati preliminari, il dottor Greg Smith per suggerimenti utili per l'analisi statistica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (NINDS IR15N5067566-01) per MSS e un Howard Hughes Medical Institute Science Education Sovvenzione al College of William and Mary.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina
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