Summary
Подготовка острых кусочков мозга от изолированного гиппокампа, а также одновременное электрофизиологических записей астроцитов и нейронов в
Abstract
Астроциты образуют вместе с нейронами трехсторонней синапсы, где они интегрируются и модулируют активность нейронов. Действительно, астроциты чувствую нейронные входы через активацию их ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов и обработки информации в части деятельности по-зависимых выпуска gliotransmitters. Кроме того, астроциты являются основной системой поглощения для глутамата, способствует калий пространственных буферизации, а также ГАМК оформления. Эти клетки таким образом постоянно контролировать синаптической активности, и тем самым чувствительным показателям изменений в синаптически выпустила глутамата, ГАМК и внеклеточного калия уровнях. Кроме того, изменения в астроглиального деятельности поглощение или буферная емкость может иметь серьезные последствия для нейронных функций, и может быть упускать из виду при характеристике патофизиологической ситуации или нокаут мышей. Двойная запись нейронов и астроглиального деятельности является важным методом изучения изменений всинаптической силы, связанные с сопутствующими изменениями в астроглиального поглощения и буферизации мощностей. Здесь мы расскажем, как подготовить срезов гиппокампа, как определить слой radiatum астроцитов, и как записать одновременно нейронов и астроглиального электрофизиологические реакции. Кроме того, мы расскажем, как изолировать фармакологически синаптически-вызванных астроглиального токов.
Protocol
1. Подготовка искусственного спинномозговой жидкости и внутриклеточного решение
- Перед началом эксперимента, нужно подготовить внутреннее решение для патч зажим записи, а также искусственные цереброспинальной жидкости (ACSF) в гиппокампе подготовки. Вы кроме того, необходимо рассечение комплект, состоящий из хирургических ножниц и тонкая диафрагма ножницы, две лопатки и щипцы (тонкие инструменты науки); устройство стекла газом (микро-фильтр свечи, РОБУ Германия) и ткань сетки (москитные сетки или нейлон плотный), а также суперклея (Uhu Dent). Конфигурация установки патча кусочек электрофизиологии была описана Финкель и Bookman, 2001 1.
- Для внутреннего решения, растворить (в мм): 105 K-глюконата, 30 KCl, 10 HEPES и 0,3 EGTA в деионизированной воде (в 70-80% от конечного объема). Охладите раствор до 4 ° C и добавить (в мм): 4 АТФ-Mg, 0,3 GTP-Tris и 10 фосфокреатина. Отрегулируйте рН до 7,4 с КОН и заливки ир деионизированной водой до конечного объема. (Osmolaritiy: ~ 280 мосм). Фильтр это решение (размер пор 0,2 мкм). Аликвоты раствор стабилен в течение 3-4 недель при - 20 ° C. За один день эксперимента, ~ 1 мл раствора внутренней необходимости.
- Если не указано иное, ACSF используется для приготовления гиппокампе и записи клеток в CA1 области, содержит (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 и 11 глюкоза. Растворите этих солей в деионизированной воде (~ 320 Осмолярность мосм) и кислородсодержащих это решение в течение 10 мин (рН ~ 7,3 - 7,4) с карбогена (95% O 2 и 5% CO 2). Подготовка по крайней мере, 1 л раствора на эксперимент. Особое внимание должны быть приняты для подготовки ткани гиппокампа, который будет использован для проведения экспериментов в CA3 регионе гиппокампа. Действительно, этот регион является склонным к эпилептиформной активности и последующее гибели нейронов. Таким образом synaptIC деятельность должна быть сильно уменьшено во время среза подготовки, и это достигается путем выполнения гиппокампа рассечение в ледяной раствор сахарозы, содержащий (в мм): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 2 CaCl, MgCl 7 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 и 75 Глюкоза сахарозы. В этом решении, в сочетании с низким содержанием натрия, кальция низкой и высокой концентрацией магния массово снижать пресинаптических стрельбы и вероятность выпуска, а также постсинаптических NMDA активность рецепторов, таким образом минимизируя спонтанной активности и гибели клеток. После приготовления срезов гиппокампа используются для записи клеток из CA3 регионе перфузии изменения ACSF, содержащего 4 мМ CaCl 2 и 4, MgSO 4, чтобы свести к минимуму полисинаптических деятельности.
2. Острый гиппокампа Подготовка Slice
- Охладить ~ 300 мл ACSF для нарезки камеры, а также для подготовки при 4 ° С, при этом постоянно кислородом скарбогена. Подготовьте небольшой стакан с ACSF при комнатной температуре (RT) для хранения срез, который также кислородом с карбогена (схема Рисунок 1).
- Anesthetize мыши под капотом с небольшим бумажным полотенцем пропитанные 1 мл изофлурана, которая добавляется в клетку.
- После того, как мышь глубоко под наркозом, отрезать голову и добавить его прямо в небольшое блюдо с ледяной кислородом ACSF. Снимите кожу головы с небольшим ножницами и передать голову на ткани для последующих шагов. Начало препарировать гиппокамп, как показано и описано на рисунке 1.
- Вырезать 300-400 мкм поперечных срезов на низкой скорости (3 мкм / сек) и вибраций частотой 70 Гц в ледяной кислородом ACSF, и перенести их в камеру хранения. Пусть ломтиками остальное при комнатной температуре в течение по крайней мере за 1 час до записи. Ломтики для CA3 экспериментов хранятся 25 мин при 34 ° C и не менее 30 минут при комнатной температуре, чтобы оправиться от нарезки процесса. 3. Двойная запись вызванных астроглиального токи и потенциалы нейронов поля
- Постоянно заливать записи камеры с кислородом ACSF (1.5-2 мл / мин, RT), содержащего 100 мкМ пикротоксина (ГАМК антагонист), чтобы изолировать возбуждающие ответы. Передача кусочек на поли-L-лизин (1,5 до 3 мг / мл) покрытием покровное, смочите жидкостью для достижения хорошей адгезии часть и добавить каплю ASCF в верхней части среза. Поместите покровное в записи камеры. Блокада тормозных передачи пикротоксина может привести к эпилептиформной активности, т. е. спонтанно, синхронное возбуждение нейронных популяций, которая будет искажать измерения вызванных событиями. Таким образом, для предотвращения эпилептиформной активности, сделатьплоский срез (только на поверхности) между CA1 и CA3 регионов, чтобы предотвратить распространение через Шаффер обеспечения (как показано на рисунке 2а).
- Stratum radiatum астроциты могут быть идентифицированы по их небольших размеров сома (~ 10 мкм) и звездчатые процесс сборки. Выберите ячейку по крайней мере, 20-30 мкм ниже среза поверхности. Установите стеклянный электрод стимуляции (макс. сопротивление ~ 1 МОм) на серебряной проволоки, подключенной к коробке изоляции стимул и заземлены на ванну (просто, обернув второй серебряной проволоки вокруг стеклянной пипетки). Поместите стимуляции электродов в область обеспечения Шаффер, как показано на рисунке 2А на расстоянии 200-300 мкм от выбранного астроцитов. Установите электрод поля записи (~ 2-5 МОм) на хлорированной серебряной проволоки подключены к headstage усилителя. Оба электрода заполнены до с ACSF. Выберите в multiclamp режиме I = 0, что отключает внешние комспрос вход и поместить электрод ~ 50 мкм от астроцитов в области radiatum слой (рис. 2A). Запишите ответы с Gain 2 до 10 и фильтр с 2 кГц фильтр Бесселя. Электрический ток инъекции в мозг срез вызывает потенциалы действия в окружающем Шаффер обеспечения аксонов и последующее освобождение передатчик на пресинаптических окончаниях, что проект постсинаптических CA1 пирамидальных нейронов. Выпустила передатчики вызовет положительный поток заряда в клетки через рецепторы постсинаптических ионотропных, который является измеримой внеклеточно в виде небольшой отрицательный потенциал. Это поле возбуждающих постсинаптических потенциалов (fEPSP) объединяет деятельность группы одновременно активных нейронов, в то время как тормозящий передачи их фармакологически. Нанесите несколько тестовых импульсов (0,1 мсек), чтобы вызвать fEPSP, некоторые репозиционирование стимуляции электродов может помочь увеличить fEPSP. Типичный CA1 слой излучающихит fEPSP показано на рисунке 2B. Более подробную информацию о позиционировании и ответов сигналы могут быть найдены в юанях и соавт. 2003 2. FEPSP амплитудой в здоровом гиппокампа ломтик обычно должны быть более чем в два раза больше амплитуды волокна залп. Для точной количественной оценки fEPSP амплитуды или склон, вызванных Réponse должны быть моносинаптических, как полисинаптических деятельности (обнаруживается как мульти-пик ответов) указывает синаптической активности зависит от электрической стимуляции, который может быть знаком для возбудимость. Для экспериментов, выполненных в СА3 области гиппокампа, стимуляции и записи пипетки позиционируется как показано на рисунке 3C. Чтобы четко определить мшистых входа волокна, которые сильно содействие, в паре-импульсной стимуляции (50 мс паузы интервал) и 1 Гц стимуляции в течение нескольких секунд применяется массово повышение исходно низкой амплитуды вызванных fEPSP responses.At концаэксперимента, DCGIV, антагонист mGluR2 / 3 рецепторов, можно мыть в дальнейшей убедиться, что действительно мшистых волокон входы были стимулированы. Применение этого антагониста должно уменьшить fEPSP на ~ 90% в связи с высокой экспрессией mGluR2 / 3 рецепторы, ингибирующие пресинаптического высвобождения из бутонов мшистых волокон.
- Заполните патч пипетки (~ 2-5 МОм) с фильтром внутреннего решения и закрепить его на хлорированной серебряной проволоки соединен со вторым headstage, применять положительное давление с помощью шприца, который подключен через трубку к вашей пипетки держателю. Постоянно применяется 20 мс тест импульса 10 мВ и переместите пипетку в ткани, пока не достигнете клеточной поверхности и отклонения в мембрана становится видимым. Обнулить пипетки смещения, удалите избыточное давление, и зажмите мембраны - 80 мВ. Подождите, пока gigaseal (по крайней мере 1 ГОм) достигается (она не должна занять больше времени, чем несколько секунд). Нежные применение некоторых отрицательное давление может помочь достичь AGigaseal. Перерыв в клетку достигается за счет коротких применения отрицательного давления или с помощью Зап функции в multiclamp. Начало одновременной регистрации залога Шаффер вызвали fEPSP и астроглиального ответ в напряжении зажим (Vhold - 80 мВ, частотой 0,1 Гц, фильтр Бесселя 2 кГц, коэффициент усиления 10). Астроглиального текущий ответ двухфазный: сначала вы увидите быстрый переходный внешним током, отражающие fEPSPs порожденных соседними пирамидальных клеток. Это сопровождается медленно поднимается и убывающих внутрь тока (сохраняющийся несколько секунд (> 10 сек) после прекращения нейронных ответов). Этот ток в основном за счет калия вступления в астроциты, после освобождения от окружающих деполяризованной постсинаптической терминалов. Одновременно активировать быстрые переходные транспортера глутамата тока (GLT), вызванный пресинаптического высвобождения глутамата маскируется калия тока. Проведение потенциал астроцитов, а также доступ к сопротивлению патча должно быть движениеnitored в течение всего эксперимента и не должна изменяться более чем на ~ 20%, чтобы избежать неточных мониторинга астроглиального Reponses в связи с изменениями условий съемки. Только астроциты с начальной потенциальной холдинг> -70 мВ должны быть исследованы для изучения здоровых клеток.
- Переход от напряжения тока Зажим для записи вызвала астроцитов деполяризации мембраны. Изолировать глиальных транспортеров глутамата (GLT) ток перфузии рецептора глутамата ионотропных блокатор кинуреновой кислоты (5 мМ), пока fEPSP полностью заблокирован и амплитуда GLT достигли плато. Чтобы четко определить GLT тока, применять специфический антагонист DL-трео-β-Benzyloxyaspartatic кислота (DL-TBOA, 200 мкМ). Увеличение стимуляции силы, 2-кратного до 5-кратного для записи нейронов и астроглиального ответных мер на различных синаптической силы и применяются два близко расположенных стимулов (50 мс интервал) для расследования ответы на парных импульсов стимуляции. Стабильность серии Resistance и мембранного потенциала глиальных клеток должны быть проверены всей записи.
- Чтобы представить себе масштабы разрыва соединения-опосредованной астроглиального сетей, красителей связи эксперименты должны быть выполнены в текущем режиме зажим, без инжекции тока, с тем чтобы пассивной диффузии низкомолекулярных красителей (<1,5 кДа), такие как сульфородамина-B, через каналы щелевых контактов. Чтобы свести к минимуму побочные красителя в окружающие ткани, положительное давление должно применяться через патч пипетки только при въезде в тканях и патч должен быть достигнут как можно скорее.
Мы здесь описано, как записать синаптически-вызванных астроглиального и нейронных ответов, т. е. ответов, индуцированная активация через синапс afference стимуляции с использованием внеклеточных электродов.
Representative Results
Представитель одновременной записи синаптически-вызванных астроглиального и нейронных ответов (fEPSPs) в CA1 области гиппокампа показано на рисунке 2 AB. Вызвали астроглиального ток двухфазный, то есть он состоит из переходных наружу текущих и медленно затухающей внутрь тока (> 10 сек) (рис. 2В). Внешнее отражает текущее вызвало fEPSP, и блокируется после торможения ионотропных глутаматных рецепторов на кинуреновой кислоты (темно-серый след, рис. 2В) 3. Большинство медленного входящего тока отражает калия вступления в астроциты следующие постсинаптической деполяризации, так как он также отменил кинуреновой кислоту, которая подавляет постсинаптических ионотропных глутаматных рецепторов деятельности (рис. 2В и 2С Рисунок 1) 3-6, известный представляют собой основной источник (80%) калия выпуска 7. Остальные быстро растетг распадающейся внутрь текущего подавляется GLT антагониста DL-TBOA (светло-серый след, рисунок 2B и 2C Рисунок 2). После специальной вычитания оставшихся медленный ток в TBOA (светло-серый след) от тока в кинуреновой кислоты (темно-серый след) позволяет изолировать чисто астроглиального транспортера глутамата тока (черная линия), как показано на рисунке 2C 2. Стойких медленно убывающих тока в кинуреновой кислоты и TBOA (светло-серый след, рисунок 2B и 2C рисунок 2) может быть заблокирован TTX (данные не представлены), и отражает, скорее всего, накопление внеклеточного К + выпущен в пресинаптических афферентных стрельбы 3. Умеренный одного стимуляции Шаффер залогов вызывает относительно большое синаптически-вызванных астроглиального тока по сравнению с небольшим вызвали деполяризации записали в той же ячейке (рис. 2D). Это связано снизкое сопротивление мембраны астроцитов. Запись вызвала синаптически-астроглиального динамику мембранного потенциала, как показано на рисунке 2D, является прямой мерой местного уровня внеклеточного калия 8. Нормализация вызвали астроглиального ответы на основные активности нейронов позволяет прямое сравнение различных экспериментов, как недавно показано 6. Астроглиального токи кроме того, может контролировать очень надежно изменений в возбуждающих передач, а общая синаптически-вызванных астроглиального текущего следующим линейно увеличение fEPSP (рис. 2E). Астроглиального токи также отражают краткосрочную синаптическую пластичность, так как они показывают, как нейроны, в паре импульс упрощению (рис. 2F). Парные цельноклеточной записи CA1 пирамидальных клеток и астроцитов показывают очень разные электрофизиологические поведения в обоих типах клеток, так как дисплей нейронов потенциалы действия в ответ на деполяризующего импульса,в то время как соседние астроциты молчит (рис. 3А-B). Тем не менее, умеренное раздражение Шаффер залога может вызвать одновременно быстро возбуждающие posynaptic потенциала в CA1 пирамидальных клеток и быстро наружу и медленно внутрь токов в соседних астроцитов (рис. 3В 2). Двойная запись синаптически-вызванных нейронов и астроглиального ответ также может быть записан в СА3 области гиппокампа, как показано на рисунке 3C. В самом деле, одна стимуляция CA3 мшистых волокон вызывает в базальных условиях очень малой нейронных реакций, регистрируются как местные fEPSPs, связанные с небольшим быстрых и медленных наружу внутренние токи в астроциты (рис. 3D-1). В отличие от 1 Гц стимуляции CA3 мшистых волокон на несколько секунд сильно усиливает fEPSP, пока это только умеренно увеличивает астроглиального ответа (Рисунок 3D-2).
Рисунок 1. Hippocampus изоляции для подготовки поперечных срезов. Чтобы препарировать мозг, разрезать череп вдоль средней линии (а). Сделать корональной разрез на уровне обонятельной луковице (б), а затем на уровне мозжечка (с). Осторожно снимите черепа с помощью щипцов (D), разделить два полушария с лезвием (е), и передавать их на небольшую ложку в холодной кислородом ACSF (F). После ~ 5 мин равновесия, поместить одного полушария на сухой ткани с медиальной поверхности вверх (г). С помощью двух ложек удалить промежуточного мозга (HJ). Гиппокамп теперь видна, как показано пунктирными линиями (к). Проанализируйте гиппокамп с ложкой в аренду, начиная с бахромкой, видны как белые структуры (лм). Передача гиппокампа обратно в холодную ACSF. Подготовьте небольшую агарозном блока, позиция двух гиппокамп с Alveus стороной вверх и брюшной гиппокампанам, стоящих перед краем агар блок, и помочь тщательно все жидкие далеко, чтобы позволить хороший привязанность к агар (п). Клей гиппокампа прикреплены к агар блок на вентральной части (о).
Рисунок 2. Одновременное нейронов и астроглиального ответы вызывали-синаптически в CA1 области гиппокампа. А) схема гиппокампа ломтик иллюстрирующие расположение стимулирующий электрод, чтобы активировать Шаффер залогов (SC), электрод патч пипетки, чтобы записать астроцитов токов и внеклеточных электродов, чтобы записать fEPSP, вызванных стимуляцией SC в гиппокампе CA1 области. Б) представитель следы одновременной записи fEPSPs (верхняя панель) и астроцитов тока (нижняя панель) вызвала синаптически по-SC стимуляции в presencе фармакологических препаратов. Ответы сначала записываются в присутствии ГАМК-рецепторов блокатор (пикротоксина, 100 мкм, черные следы), чтобы изолировать возбуждающие ответы. Последующее применение рецептора глутамата ионотропных блокаторы (кинуреновой кислоты, 5 мм, темно-серые следы), тормозит fEPSP и большая часть длительный астроглиального тока, разоблачая маленькие и быстрые переходные компоненты астроцитов текущий ответ, который чувствительны к глутамат блокатор транспортер (TBOA, 200 мкм, светло-серые следы). Шкала бар, fEPSP 0,1 мВ, астроцитов ток 15 мкА, 10 мс. C 1). Пример след астроглиального калия текущей (1-2), который может быть изолирован от вызвала отклик, показанный на B (нижняя панель, черный след), путем вычитания текущего компонента, оставшихся в кинуреновой кислоты (2) от общего тока ( 1). Шкала бар, 20 Па, 1 сек. C 2) Пример след транспортера глутамата текущей (2-3), получаемой путем вычитания TBOA яnsensitive медленного компонента (3) от тока в кинуреновой кислоты (2). Шкала бар, 2,5 мкА, 25 мсек. D) Пример следы входящего тока, записанные в напряжении зажим (нижняя панель) и соответствующие деполяризации мембраны, записанных в текущем зажим (верхняя панель), индуцированный в астроцитов путем стимуляции SC. Шкала бар, ток зажима 1,5 мВ, напряжение, зажим 5 Па, 1 сек. E) ввода-вывода кривые, иллюстрирующие связь между пресинаптического волокна залпов (вход) и общее астроглиального ток (выход) записываются одновременно в ответ на стимуляцию SC (n = 6). Астроглиального ток увеличивается линейно с увеличением залпы волокна, как нейронные fEPSP. F) Пример следы нейронные реакции (fEPSP) и астроцитов текущего показаны для парных импульсов стимуляции на 40 мс интервал паузы. Синаптически-вызванных астроглиального текущего экспонаты, такие как нейроны, парных импульсов процедур. Шкала бар, 0,1 мВ, 5 Па, 20 мс.
Рисунок 3. Двойной записи синаптически вызванных нейронов и астроглиального ответы в CA1 и CA3 областей гиппокампа. A) Реконструкция CA1 пирамидальные клетки вводили сульфородамина-B (красный, 0,1%) и астроцитов заполнены флуоресцеина декстрана (зеленый, 0,1%), использование целых клеток патч-зажим техники. Шкала бар, 10 мкм. B 1) представитель следы одновременного цельноклеточной записи мембранных потенциалов, записанных в текущем зажим от CA1 пирамидальных клеток и соседних астроцитов. Нейронов потенциал действия (черный след), вызванного введением 20 пА деполяризующего импульса тока, вызывает никакой реакции в соседних астроцитов (серая линия). Шкала бар, 20 мВ, 10 мкА, 100 мс. B 2) Пример следы двойного цельноклеточной записи CA1 пирамидальные клетки в текущем моллюска-р и соседних астроцитов в напряжении зажим SC после стимуляции в присутствии пикротоксина (100 мкМ). SC стимуляция вызывает возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП, черный след), связанных с малым и длительный астроцитов тока (серая линия). Шкала бар, 5 мВ, 10 мкА, 100 мс. C) Схема гиппокампа ломтик изображающие в зубчатой извилине (DG) и СА3 области расположения стимулирующих электродов, чтобы активировать мшистых волокон, электродов патч пипетки (серый), для записи астроцитов токов и внеклеточных электродов, чтобы запись fEPSP, вызванных CA3 мшистых стимуляции волокон. D, E) представитель следы парных записей CA3 fEPSPs (верхней панели, черные следы в D 1 и D 2) и астроцитов все-клеточного ответа (нижние панели, серые следы в D 1 и D 2) в одном стимуляции CA3 мшистых волокон на 0,02 Гц (увеличение на вставке) (D 1) или с частотой 1 Гц частоты стимуляции (D 2). Шкала бар D
Discussion
Двойная запись синаптически-индуцированной нейронов и глиальных ответов является полезным методом для изучения онлайн изменениях в пре-и постсинаптических деятельности, связанные с изменениями в астроглиального свойства. Синаптически-вызванных глиальных деполяризация мембраны является прямой мерой внеклеточного калия рост 8, отчасти из-за пресинаптических стрельбы потенциал действия, но в основном постсинаптической деполяризации 7. Поэтому записи глиальных динамику мембранного потенциала может быть использован для исследования изменений в пресинаптических возбудимость, постсинаптической активности, объема внеклеточной пространстве и калия возможности буферизации 6, 8. Астроглиального текущего транспортера глутамата является чувствительной мерой пресинаптического высвобождения глутамата, в состоянии контролировать краткосрочных изменений в релизе вероятностью 3, 5, 9. Он может быть дополнительно использованы для характеристики функционального синапс-глии взаимодействий на разных синапсов или в разное развития Санкт-возраст от 10. Следует подчеркнуть, что GLTs очень чувствительны к температуре 11 и приводятся в действие электрохимической градиента Na +, K + и H +12. Таким образом, амплитуды и кинетики GLT текущего сильно зависит от выбранных условий эксперимента. Кроме того, реальный ход времени астроглиальных оформления глутамата, полученные из записанных текущего GLT, как известно, частично скрыт. Это связано с фильтрацией GLT токи такие факторы, как электротонические свойствам астроциты или асинхронного выпуска передатчик, который искажает их кинетики 13. Методы извлечения временных особенностей механизмов фильтрации были разработаны и могут быть использованы для получения фактических глутамата время очистки курс в физиологических или патологических ситуациях, как recenly выполнены 6,13,14. Кроме того, одновременная запись астроглиального деполяризации мембраны, в токовые клещи, может обеспечить незначительныHTS возможные изменения внеклеточного калия переходных процессов. Одноместный астроциты обратиться до 100.000 синапсов ~ 100 различных нейронах, и не потому интеграции и модулируют активность местных нейронных сетей.
При использовании техники, представленные здесь, т. е. записи электрофизиологических все-клеточного ответа из астроцитов, чтобы получить представление базального синаптической активности, следует иметь в виду, что астроциты, патч-зажим записи на уровне сомы позволяют обнаруживать токи основном происходящие из клеток сомы или проксимальных процессов. Действительно, токи обнаружены на сомы лишь частично происходят от мелких дистальных процессов, когда сильная активация рецепторов и каналов, происходящих в несколько тонких процессов может генерировать токи, распространяющиеся в клетку сомы. Таким образом, базальная рецептор и канал активности в отдельных небольших астроглиального синаптических процессов, охватывающих отсеков трудно обнаружить. Это связано отчасти с ограниченной плюнулриала и временной контроль мембранных токов и напряжений на целых клеток патч-зажим записи из астроцитов на месте. Тем не менее, следует отметить, что поверхность обильным крошечные астроцитов процессов значительно превышает площадь мембраны из сома и основные процессы. Кроме того, эти perisynaptic астроглиального микродоменов содержаться функционально соответствующих рецепторов и каналов, которые, вероятно, играют важную роль в нейроглии связи и синаптических регулирования. Техника мы представили здесь, поэтому наиболее полезна для изучения астроцитов интеграция синхронной активности нейронных ансамблей, происходящих в частности, во время afference стимуляции. Она не должна быть использована для изучения диалога между отдельными синапсов и прилегающих штрафа астроцитов процессов, происходящих при базально спонтанной активности. Альтернативный метод для изучения местных астроглиального ответов, индуцированная базальную синаптическую деятельность будет выполнять патч-зажим записи из тонких процессов, а годин в дендритах 15. Несмотря на исправление этих прекрасных астроглиального процессы, скорее всего, сталкивается с проблемами из-за их небольшого размера, это, вероятно, проспект проводить, чтобы распутать более интимной диалог между астроглиального микродоменов и индивидуальных синапсов. Тем не менее, вероятно, небольшое электрофизиологических астроглиального ответов в результате отдельных тонких астроглиального процессов может быть ниже порога обнаружения, так как электрический шум достигает в среднем 3-5 годовых в патч-зажим записи. Другой метод изучения астроглиального ответы на синаптической активности кальция изображений, так как активация астроцитов мембранных рецепторов или перевозчиков веществами нейроактивные может вызвать внутриклеточного кальция переходные. Тем не менее, массовая загрузка астроцитов с кальцием показатели могут также отражают в основном соматическими деятельности 16. Сочетание изображений электрофизиологии и кальция также позволяет обнаружения слабых сигналов кальция из тонкой астроглиального процессы, происходящие либо спонтанно, либо срабатывает бУ минимальная стимуляция синаптической 17, 18. Тем не менее, следует иметь в виду, что высокое сродство показатели кальция может действовать как кальций буфера, препятствуя важным кальцием сигнальных путей, в то время как низкоаффинных показатели могут работать ниже уровня обнаружения. Наконец, элегантный и неинвазивный метод для изучения событий кальция в тонкой астроцитов процессы, которые также обходит вымывания внутриклеточных сигнальных молекул, в течение целых клеток патч-зажим, состоит в использовании мембраны целевых кальция датчик, который может быть выражен в астроциты на местах, а также в естественных условиях 19. Тем не менее, кальция изображений может предоставить только информацию об одной сигнальной молекулой, которая участвует во многих, но не всех сотовых деятельности, в то время как целых клеток патч-зажим обеспечивает количественную информацию обо всех различных ионные токи вызвали на канал и активации рецептора. Поэтому одновременное электрофизиологических записей из нейронов и астроцитовпредставляют собой уникальный и мощный метод, чтобы разгадать онлайн динамики нейроглии ионной сигнализации и ее роль мозга обработки информации.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, и Роха Chopier, который сделал видео и анимации, а также Флориан Бек на фотографиях и пост-продакшн видео голос за кадром. Эта работа была организована Олимп и поддержана грантами от HFSPO (Award развития карьеры), ANR (Программа Jeunes chercheurs и программы Blanc нейронаук), FRC (Федерация Pour La Recherche сюр-ле-Cerveau), INSERM и Ла-Питье Сальпетриер больницы (Трансляционные исследования контракт) для NR, по-французски исследований Министерства и Deutsche Forschungsgemeinschaft постдок стипендии, и от докторской школе "Границы в Life Science", Париж Дидро университета, Бетанкур Шуллер фундамент, и FRM (Fondation Pour La Recherche Médicale) докторские стипендии для JS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C.
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al.
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
