Summary
ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים ב
Abstract
האסטרוציטים יוצרים יחד עם סינפסות משולשות נוירונים, שבו הם משתלבים ולווסת את הפעילות עצבית. אכן, האסטרוציטים לחוש תשומות עצביות באמצעות הפעלה של תעלות היונים שלהם ואת הקולטנים של נוירוטרנסמיטרים, ולעבד מידע בחלקו באמצעות שחרור פעילות התלוי של gliotransmitters. יתר על כן, האסטרוציטים מהווים מערכת הספיגה העיקרית לגלוטמט, לתרום לחציצה מרחבית אשלגן, כמו גם לאישור GABA. תאים אלה ולכן כל זמן לעקוב אחר פעילות הסינפטית, ובכך הם אינדיקטורים רגישים לשינויים בגלוטמט שפורסם synaptically, רמות ה-GABA ותאיות אשלגן. בנוסף, שינויים בפעילות ספיגת astroglial או קיבולת חציצה יכולים להיות השפעה חמורה על תפקוד עצבי, והייתי עלולים להחמיץ כאשר אפיון מצבי physiopathological או עכברים בנוקאאוט. הקלטה כפולה של פעילות עצבית וastroglial לכן שיטה חשובה ללמוד שינויים בכוח הסינפטי קשור לשינויים בספיגה נלווית astroglial ויכולות חציצה. כאן אנו מתארים כיצד להכין פרוסות ביפוקמפוס, כיצד לזהות האסטרוציטים שכבת radiatum, ואיך לרשום תגובות אלקטרופזיולוגים זמנית עצביות וastroglial. יתר על כן, אנו מתארים כיצד לבודד פרמקולוגית זרמי astroglial עוררו-synaptically.
Protocol
1. הכנת נוזל השדרתי מלאכותי ופתרון תאי
- לפני שתתחיל בניסוי, צריך להכין את הפתרון הפנימי להקלטות תיקון המהדק, כמו גם הנוזל השדרתי המלאכותי (ACSF) להכנת היפוקמפוס. אתה יתר תצטרך ערכת נתיחה בהיקף של מספריים כירורגית ומספריים בסדר איריס, שתי מריות ומלקחיים (כלי המדע פיין); מכשיר המתת זכוכית (נר מייקרו מסנן, ROBU גרמניה) ורשת רקמות (נטו או ניילון יתוש הדוק), כמו גם דבק מגע (דנט Uhu). תצורת התקנת תיקון פרוסת electrophysiology תוארה על ידי פינקל & Bookman 2001 1.
- לפתרון הפנימי, לפזר (במ"מ): 105 K-גלוקונאט, 30 KCl, 10 HEPES ו0.3 EGTA במים (בdeionized 70-80% מהנפח הסופי). לקרר את הפתרון ל4 מעלות צלזיוס ולהוסיף (במ"מ): 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-טריס ו10 phosphocreatine. התאם את ה-pH ל 7.4 עם KOH והמילוי up עם מי deionized לנפח הסופי. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). סנן את הפתרון הזה (0.2 מיקרומטר גודל נקבובי). פתרון Aliquoted הוא יציב במשך 3-4 שבועות ב-- 20 ° C. ליום ניסיון אחד, ~ 1 מ"ל של הפתרון הפנימי הוא זקוקים.
- אלא אם נאמר אחרת, ACSF משמש להכנת היפוקמפוס והקלטות של תאים באזור CA1, מכיל (במ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgSO 4, 1 nah 2 PO 4, 26.2 NaHCO 3 ו 11 גלוקוז. ממס מלחים אלו במי deionized (אוסמולריות ~ 320 mOsm) וחמצן פתרון זה במשך לפחות 10 דקות (pH ~ 7.3-7.4) עם carbogen (95% O 2 ו 5 CO 2%). הכן ליטר לפחות 1 מתוך פתרון לניסוי. זהירות מיוחדת יש לנקוט להכנת רקמת היפוקמפוס שישמש לביצוע ניסויים באזור CA3 של ההיפוקמפוס. ואכן, באזור זה נוטה epileptiform פעילות עצבי ומוות לאחר מכן. כך synaptפעילות ic יש לצמצם מאוד במהלך הכנת פרוסה, ודבר זה נעשה על ידי ביצוע נתיחת היפוקמפוס בתמיסה קרה כקרח המכיל סוכרוז (מ"מ): 87 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 nah 2 4 ת.ד. , 25 3 NaHCO, 10 גלוקוז וסוכרוז 75. בפתרון זה, שילוב של נתרן נמוך, סידן נמוך וריכוזי המגנזיום גבוהים מסיבי להפחית ירי presynaptic והסתברות שחרור, כמו גם פעילות הקולטן NMDA postsynaptic, ובכך לצמצם פעילות ספונטנית ומוות של תאים. פרוסות ברגע מוכנה, היפוקמפוס משמשים להקלטות של תאים מאזור CA3 הם perfused עם modified ACSF, המכילה 4 המ"מ CaCl 2 ל 4 MgSO 4, לצמצום פעילות polysynaptic.
2. הכנה פורס היפוקמפוס חריפה
- להתקרר ~ 300 מ"ל של ACSF לחדר החיתוך, כמו גם להכנה ב 4 ° C, תוך ניסיון מתמיד עם oxygenatingcarbogen. הכן את ספל קטן עם ACSF בטמפרטורת חדר (RT) לאחסון פרוס, שגם הוא מחומץ עם carbogen (איור Scheme 1).
- הרדם את העכבר תחת מכסה מנוע עם נייר מגבת קטנה ספוגה בisoflurane 1 המ"ל שהוסיף לכלוב.
- אחרי העכבר הוא מורדם עמוק, ערף את הראש ולהוסיף אותו ישירות לצלחת קטנה עם ACSF חומץ קר כקרח. הסר את הקרקפת עם מספריים קטנים ולהעביר את הראש על רקמות לשלבים הבאים. התחל לנתח היפוקמפוס, כפי שמודגם באיור ותאר 1.
- חותך 300-400 מיקרומטר פרוסות רוחביות עבות במהירות נמוכה (3 מיקרומטר / שני) ותדירות רטט של 70 הרץ בקר כקרח מחומץ ACSF, ולהעביר אותם לתוך תא אחסון. בואו שאר פרוסות בRT להקלטה לפחות 1 שעות לפני. פרוסות לCA3 ניסויים מאוחסנות 25 דקות ב34 ° C ולפחות 30 דקות ב RT, כדי להתאושש מתהליך החיתוך. 3. הקלטה כפולה של זרמי Astroglial עוררו ופוטנציאל שדה עצבי
- כל זמן תנקב את תא ההקלטה עם החומץ ACSF (1.5-2 מ"ל / דקה, RT), המכיל picrotoxin מיקרומטר 100 (GABA אנטגוניסט) כדי לבודד תגובות מעוררות. העברת פרוסה על coverslip מצופה פולי-L-ליזין (1.5-3 מ"ג / מ"ל), יש להשרות את הנוזל על מנת להשיג הידבקות פרוסה טובה ולהוסיף טיפת ASCF על גבי הפרוסה. הנח את coverslip לתא ההקלטה. מצור של שידור מעכב ידי picrotoxin יכול לגרום לפעילות epileptiform, כלומר ירי ספונטני, סינכרוני של אוכלוסיות עצביות, שיעוות את המדידה של אירועים עוררו. לכן, כדי למנוע פעילות epileptiform, לעשותחתך שטוח (רק את פני השטח) בין CA1 וCA3 האזורים כדי למנוע את ההתפשטות באמצעות בטוחות שפר (כפי שמצוין באיור 2 א).
- האסטרוציטים שכבת radiatum ניתן לזהות לפי הגודל שלהם קטנים סומה (~ 10 מיקרומטר) והרכבת תהליך דמוית כוכב. בחר תא לפחות 20-30 מיקרומטר מתחת לפני שטח הפרוסה. הר האלקטרודה גירוי זכוכית (התנגדות קצה ~ 1 MΩ) בחוטי הכסף שמחובר לתיבת בידוד הגירוי ומקורקע לאמבטיה (פשוט על ידי עטיפת חוט הכסף סביב 2 הכוס פיפטה). הנח את האלקטרודה הגירוי לאזור ביטחונות שפר, כפי שמצוין באיור 2A במרחק של 200-300 מיקרומטר הרחק מastrocyte בחר. הר האלקטרודה הקלטת השדה (~ 2-5 MΩ) על חוט כסף כלור מחובר לheadstage של המגבר. שני אלקטרודות מלאות לפני עם ACSF. בחר בmulticlamp המצב אני = 0, שמשבית com החיצוניקלט מאנד ולמקם את האלקטרודה במרחק ~ 50 מיקרומטר מastrocyte לאזור radiatum השכבה (איור 2 א). הקלט את התגובות עם רווח 2-10 ומסנן עם 2 קילוהרץ Bessel מסנן. הזרקת זרם חשמלית לתוך פרוסת המוח מפעילה פוטנציאל פעולה באקסונים המקיפים שפר הטחונות ושחרור משדר עוקב במסופי presynaptic שפרויקט CA1 עצב פירמידליים postsynaptic. המשדרים פורסמו יפעילו זרימה חיובית אחראית לתוך התאים דרך הקולטנים ionotropic postsynaptic, שהוא מדיד extracellularly כפוטנציאל שלילי קטן. פוטנציאל זה תחום מעורר postsynaptic (fEPSP) משלב את הפעילות של קבוצה של תאי עצב פעילים בו זמנית, בזמן שידור מעכב חסום פרמקולוגית. תחול כמה פולסים בדיקה (0.1 אלפיות משך) לעורר fEPSP; חלק מחדש של האלקטרודה הגירוי יכול לסייע להגביר את fEPSP. טיפוסי CA1 שכבת radiatאממ fEPSP מודגם באיור 2B. פרטים נוספים על מיקום וגלי תגובה ניתן למצוא ביואן ואח'. 2 2003. המשרעת fEPSP בפרוסת ההיפוקמפוס בריאה בדרך כלל צריכה להיות יותר גדול פי שתיים מהאמפליטודה של מטח הסיבים. לכימות מדויק של משרעת או מדרון fEPSP, reponse עורר צריכה להיות monosynaptic, כפעילות polysynaptic (זיהוי כתגובה מרובה שיא) מראה על פעילות הסינפטית תלויה בגירוי החשמלי, שיכול להיות סימן לרגשנות יתר. לניסויים שבוצעו באזור CA3 של ההיפוקמפוס, הגירוי וpipettes הקלטה ממוקמים כפי שמודגמים באיור 3C. לזהות בבירור תשומות טחובות סיבים, אשר בתוקף הוא להקל, גירוי דופק לזווג (50 אלפיות interpulse מרווח) וגירוי הרץ 1 לכמה שניות מיושמים בצורה מסיבית כדי לשפר את המשרעת הנמוכה בתחילה עוררה fEPSP responses.At הסוףשל הניסוי, DCGIV, אנטגוניסט mGluR2 / 3 הקולטן, ניתן לשטוף בהמשך כדי לוודא שאכן תשומות סיבים טחובות היו מגורה. היישום של יריב זה אמור להפחית את fEPSP ידי ~ 90% בשל הביטוי הגבוה של mGluR2 / 3 קולטנים, שחרור סינפטי מעכב מboutons סיבים הטחובים.
- מלא תיקון פיפטה (~ 2-5 MΩ) עם פתרון הפנימי מסונן ולהעלות אותו על חוט כסף כלור מחובר לheadstage השני, להפעיל לחץ חיובי עם מזרק, שמחובר באמצעות צינור לבעל פיפטה שלך. כל זמן להחיל דופק מבחן 20 אלפיות של 10 mV ולהזיז את פיפטה לתוך הרקמה עד שתגיע לתא השטח וסטייה בקרום הופכת לגלויה. לאפס פיפטה קיזוז, הסר את הלחץ החיובי, ומהדק את הקרום ל-- mV 80. חכה עד gigaseal (לפחות 1 GΩ) הוא הגיע (זה לא צריך לקחת יותר מכמה שניות). יישום עדין של כמה לחץ שלילי עשוי לעזור להגיע AGigaseal. לפרוץ לתא מושג על ידי יישום קצר של לחץ שלילי או באמצעות פונקצית zap בmulticlamp. התחל הקלטה סימולטני של ביטחונות שפר עוררו fEPSP ותגובת astroglial במהדק מתח (Vhold - 80 mV; תדר 0.1 הרץ, 2 קילוהרץ מסנן הסל, רווח 10). התגובה הנוכחית astroglial היא פאזית: ראשונה שתראה נוכחי החוצה חולף מהר, המשקף fEPSPs שנוצר על ידי תאי פירמידה סמוכים. זה ואחריו (כמה שניות מתמידות (> 10 שניות) לאחר סיום תגובות עצביות) עולים לאט ובריקבון פנימיות נוכחיות. הנוכחי הוא בעיקר עקב כניסת אשלגן לתוך האסטרוציטים, לאחר שחרורו על ידי הסובבים מסופי postsynaptic depolarized. טרנספורטר הופעל בו זמנית במהירות חולפת גלוטמט הנוכחי (GLT), מופעל על ידי שחרור גלוטמט presynaptic מוסווה בזרם אשלגן. פוטנציאל החזקת astrocyte, כמו גם את התנגדות הגישה של התיקון צריך להיות מוnitored לאורך הניסוי ולא צריך להשתנות יותר מ ~ 20%, כדי להימנע מניטור מדויק של reponses astroglial עקב שינויים בתנאי ההקלטה. האסטרוציטים רק עם פוטנציאל החזקה ראשוני> -70 mV צריכים להיחקר ללמוד תאים בריאים.
- עבור ממתח למהדק נוכחי כדי להקליט את שלילת קוטביות קרום astrocytic עוררה. מבודד טרנספורטר גלוטמט גליה (GLT) נוכחי על ידי טפטוף של חומצת ionotropic גלוטמט רצפטור חוסם kynurenic (5 מ"מ), עד fEPSP חסום באופן מלא ומשרעת GLT הגיע לרמה מסוימת. לזהות בבירור הנוכחי GLT, להחיל את היריב הספציפי חומצת β-Benzyloxyaspartatic DL-threo (DL-TBOA, 200 מיקרומטר). להגביר את עוצמת הגירוי על ידי 2-5-לקפל קיפול לרשום תגובות עצביות וastroglial בחוזק הסינפטי שונה, ולהחיל שני גירויי רווח מקרוב (50 אלפיות מרווח) כדי לחקור את התגובות לגירויי דופק מותאם. יציבות של הסדרה Rפוטנציאל esistance וקרום של תא גליה צריך להיות במעקב לאורך כל ההקלטה.
- כדי להמחיש את מידת פער הצומת מתווכת רשתות astroglial, ניסויים לצבוע צימוד יש לבצע במצב הנוכחי מהדק, ללא כל הזרקה נוכחית, כדי לאפשר דיפוזיה פסיבית של צבעים מולקולריים נמוכים (<1.5 KDA), כגון sulforhodamine-B, באמצעות ערוצי צומת פער. כדי למזער גלישת צבע לתוך הרקמה הסובבת, לחץ חיובי צריך להיות מיושם באמצעות פיפטה התיקון רק כאשר נכנסים לרקמות והתיקון יש להגיע בהקדם האפשרי.
אנחנו כאן לתאר כיצד להקליט synaptically-עורר תגובות astroglial ועצביות, תגובות כלומר הנגרמות על ידי הפעלת סינפסה באמצעות גירוי afference באמצעות אלקטרודה תאית.
Representative Results
הקלטה בו זמנית של נציג תגובות astroglial ועצביות עוררו-synaptically (fEPSPs) באזור CA1 של ההיפוקמפוס מוצגת באיור 2 AB. הנוכחי הוא astroglial עורר פאזית, כלומר הוא מורכב מנוכחי החוצה חולף ונוכחי פנימה מתפרק אט אט (> 10 שניות) (איור 2 ב '). כלפי חוץ הנוכחי משקף fEPSP עורר, ונחסם לאחר העיכוב של קולטני גלוטמט ionotropic ידי חומצת kynurenic (אפור כהים עקבות, התרשים 2B) 3. רוב הנוכחי פנימה האיטי משקף כניסת אשלגן לשלילת קוטביות postsynaptic הבאה astrocyte, שכן הוא גם בוטל על ידי חומצת kynurenic, המעכבת את פעילות קולטן הגלוטמט ionotropic סינפטי (האיור 2B ואיור 2C 1) 3-6, הידוע לייצג העיקרי המקור (80%) של שחרור אשלגן 7. שנותר במהירות העולהנוכחי פנימה מתפורר ד מעוכב על ידי יריב GLT DL-TBOA (אור אפורים עקבות, התרשים 2B ואיור 2C 2). פוסט הוק חיסור של הזרם האיטי שנותר בTBOA (אור האפור עקבות) מהנוכחי בחומצת kynurenic (אפור כהות עקבות) מאפשר הבידוד של טרנספורטר הטהור astroglial גלוטמט הנוכחי (עקבות שחורות), כפי שמודגם באיור 2C 2. ריקבון המתמשך לאט נוכחי בחומצת kynurenic וTBOA (אור אפורים עקבות, התרשים 2B ואיור 2C 2) יכול להיות חסום על ידי TTX (מידע לא מוצג), ומשקפת את ההצטברות של K התאי כנראה + שוחררה במהלך הירי מביא presynaptic 3. גירוי יחיד מתון של שפר טחונות גורם נוכחי astroglial גדול יחסית עורר-synaptically לעומת שלילת הקוטביות עוררה הקטנה נרשמה באותו התא (האיור 2D). זאת בשלהתנגדות קרום נמוכה של האסטרוציטים. הקלטה של הדינמיקה פוטנציאלי קרום astroglial עוררה-synaptically, כפי שמודגם באיור 2D, היא מדד ישיר של רמות אשלגן תאיות מקומיות 8. נורמליזציה של תגובות astroglial עוררו לפעילות העצבית הבסיסית מאפשרת השוואה הישירה של ניסויים שונים, המוצגת כ6 לאחרונה. זרמי Astroglial יתר יכולים לפקח באופן אמין ביותר שינויים בהעברה מעוררת, כנוכחי astroglial הסך עורר-synaptically כדלקמן העלייה בfEPSP (2E איור) באופן ליניארי. זרמי Astroglial משקפים גם פלסטיות הסינפטית לטווח קצר, שכן הם מראים, כנוירונים, דופק לזווג הנחיית (האיור 2F). הקלטה לזווג כל התאים של תא פירמידלי CA1 וastrocyte לחשוף התנהגות אלקטרו שונה מאוד בשני סוגי התאים, מכיוון שפוטנציאל פעולת תצוגת נוירון בתגובה לדופק depolarizing, בעוד astrocyte השכן שותק (איור 3A-B). עם זאת, גירוי מתון של ביטחונות שפר יכול לעורר בו זמנית פוטנציאל posynaptic מעורר במהירות בתא פירמידלי CA1 ועוד זרמים חיצוניים ואיטיים מהירים פנימה בastrocyte הסמוך (איור 3B 2). הקלטות כפולות של תגובות עצביות וastroglial עוררו-synaptically גם יכולות להיות מוקלטות בCA3 האזור של ההיפוקמפוס, כפי שמוצגת באיור 3 ג. ואכן, גירוי יחיד של CA3 סיבים טחובים מעורר בתנאי בסיס, תגובות עצביות קטנות מאוד, שנרשמו כfEPSPs מקומי, הקשורים לזרמים קטנים מהירים חיצוניים ואיטיים פנימה בהאסטרוציטים (איור 1 3D). בניגוד לכך, גירוי של 1 ההרץ CA3 סיבים טחובים לכמה שניות חזקה מגביר fEPSP, בזמן שהוא מתון בלבד מגביר את תגובת astroglial (האיור 3D 2).
עמודים דקים = "תמיד"> 
איור 1. בידוד ההיפוקמפוס להכין פרוסות רוחביות. כדי לנתח את המוח, לחתוך לחתור לאורך קו האמצע (א). לעשות חתך עטרה ברמה של נורת חוש הריח (ב) ולאחר מכן ברמה של המוח הקטן (ג). מוציא בזהירות מהשוט עם העזרה שלו מלקחיים (ד), יש להפריד בין שתי ההמיספרות עם להב (ה), ולהעביר אותם בכפית קטנה לACSF חומץ הקר (ו). לאחר 5 דקות ~ איזון, הנח אונה אחד על רקמה יבשה עם המשטח המדיאלי עד (ז). בעזרת שתי כפות להסיר diencephalon (hj). ההיפוקמפוס הוא עכשיו גלוי, כפי שהומחש על ידי קווים מהקווקווים (k). מנתח את ההיפוקמפוס עם כף החוצה, החל מfimbria, גלוי כמבנה לבן (lm). העברת היפוקמפוס בחזרה לACSF הקר. הכן קטן agarose-בלוק, עמדת 2 hippocampi עם צד alveus וhippocamp הגחוןמולנו הקצה של הגוש אגר, ולספוג בזהירות את כל הנוזלים משם כדי לאפשר חיבור טוב לאגר (n). דבק היפוקמפוס מחובר לגוש אגר על החלק הגחוני (O).
איור 2. תגובות עצביות וastroglial סימולטאני עוררו-synaptically באזור CA1 של ההיפוקמפוס. ) ערכה של פרוסת היפוקמפוס ממחיש את הסידור של האלקטרודה מגרה, כדי להפעיל את בטוחות שפר (SC), אלקטרודה פיפטה התיקון, להקליט זרמי astrocytic, והאלקטרודה התאית, להקליט fEPSP, עורר על ידי גירוי SC ביפוקמפוס אזור CA1. B) עקבות מייצגות של הקלטות בו זמניות של fEPSPs (פנל העליון) וזרמי astrocytic (פנל תחתון) עורר-synaptically ידי גירוי SC בpresencדואר של תרופות פרמקולוגיות. התשובות נרשמות ראשונה, בנוכחותו של GABA חסמי רצפטור (picrotoxin, 100 מיקרומטר, עקבות שחורות) כדי לבודד תגובות מעוררות. יישום עוקב של חוסם קולטן הגלוטמט ionotropic (חומצת kynurenic, 5 מ"מ, עקבות אפורות כהות), מעכב את fEPSP וחלק הגדול מהנוכחי astroglial ארוך הטווח, ויחשוף את מרכיב קטן וזמני של מהירות התגובה הנוכחית astrocytic, שהוא רגיש לחוסם טרנספורטר גלוטמט (TBOA, 200 מיקרומטר, עקבות אפורות בהירות). סרגל קנה מידה, fEPSP 0.1 mV, astrocytic הנוכחית 15 הרשות הפלסטינית, 10 אלפיות השני. ג 1). עקבות מדגם של אשלגן astroglial הנוכחי (1-2), שניתן לבודד מהתגובה עוררה, שמוצגת בB (פנל תחתון, סימן שחור), בהפחתת הרכיב הנוכחי נותר בחומצת kynurenic (2) מהשוטף ( 1). סרגל קנה מידה, 20 רשות הפלסטינית, 1 שניות. ג 2) לדוגמא עקבות של טרנספורטר גלוטמט הנוכחי (2-3), מתקבל על ידי חיסור של TBOA מרכיב nsensitive איטי (3) מהנוכחי בחומצת kynurenic (2). סרגל קנה מידה, 2.5 רשות הפלסטינית, 25 אלפיות השני. ד) עקבות לדוגמה בזרם פנימה נרשמו במתח-clamp (פנל תחתון) ושלילת קוטביות הממברנה המקבילה נרשמה ב- מהדקים נוכחי (פנל העליון) מושרה בastrocyte ידי גירוי SC. סרגל קנה מידה, נוכחי לצבוט 1.5 mV, מתח-מהדק 5 רשות פלסטינית, 1 שניות. E) עקומות קלט פלט הממחישים את הקשר בין מטחי presynaptic סיבים (קלט) והנוכחיים astroglial כוללים (פלט) נרשמו בו זמנית בתגובה לגירוי SC (n = 6). עליות astroglial הנוכחיות ליניארי עם מטחי סיבים המוגברים, כfEPSP העצבי. F) עקבות לדוגמה בתגובה העצבית (fEPSP) והנוכחי astrocytic מוצגות לגירוי לזווג דופק במרווח 40 אלפיות interpulse. מוצגי astroglial הנוכחיים עוררו-synaptically, כמו נוירונים סיוע, לזווג דופק. סרגל קנה מידה, 0.1 mV, 5 רשות הפלסטינית, 20 אלפיות השני.
דף = "תמיד"> 
איור 3. הקלטות כפולות של תגובות עצביות וastroglial synaptically מושרים בCA1 וCA3 האזורים של ההיפוקמפוס. ) שחזור של תא פירמידלי CA1 הוזרק sulforhodamine-B (אדומים, 0.1%) וastrocyte מלאים עם fluorescein dextran (ירוק, 0.1%), תוך שימוש בטכניקה כל תא תיקון-clamp. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. B 1) עקבות מייצגות של הקלטות בו זמנית כל התאים של פוטנציאל ממברנה שנרשם ב- מהדקים נוכחי מתא פירמידלי CA1 וastrocyte סמוך. ירי פוטנציאל פעולה עצבי (עקבות שחורות), עורר על ידי הזרקה של 20 PA depolarizing דופק נוכחי, מעורר כל תגובה בastrocyte הסמוך (אפור זכר). סרגל קנה מידה, 20 mV, 10 רשות הפלסטינית, 100 אלפיות השני. B 2) לדוגמא עקבות של הקלטות כפולות כל התאים של תא פירמידלי CA1 בנוכחי צדפותp ו astrocyte שכן במתח-מהדקים לאחר גירוי SC בנוכחות picrotoxin (100 מיקרומטר). גירוי מעורר SC פוטנציאל מעורר postsynaptic (EPSP, סימן שחור), הקשורים לקטן וארוך טווח נוכחי astrocytic (אפור זכר). סרגל קנה מידה, 5 mV, 10 רשות הפלסטינית, 100 אלפיות השני. ג) ערכה של פרוסת היפוקמפוס מתארת ברכס המשונן (DG) וCA3 אזורי סידור האלקטרודה מגרה, כדי להפעיל את סיבי טחבים, אלקטרודה פיפטה התיקון (אפור), כדי להקליט זרמי astrocytic והאלקטרודה התאית, כדי השיא fEPSP, עורר על ידי גירוי סיבי אזובים CA3. D, E) עקבות מייצגות של הקלטות לזווג של CA3 fEPSPs (פנלים עליונים, עקבות שחורות ב1 ד ו ד 2) ותגובות כל תאי astrocytic (פנלים נמוכים, עקבות אפורות ב1 ד ו ד 2) לגירוי בודד של CA3 אזוב סיבים ב0.02 רץ (זום בהבלעה) (1 ד) או בתדירות גירוי הרץ 1 (ד 2). סרגל קנה מידה לD
Discussion
הקלטה כפולה של תגובות עצביות וגלייה-Induced synaptically היא שיטה שימושית ללמוד שינויים בפעילות באינטרנט לפני וpostsynaptic הקשורים לשינויים בתכונות astroglial. שלילת קוטביות קרום גליה עוררה-synaptically היא מדד ישיר של עליית אשלגן התאית 8, נובעת בחלקו ירי פוטנציאל פעולה presynaptic, אבל בעיקר לשלילת קוטביות postsynaptic 7. לכן הקלטות של דינמיקה פוטנציאלית קרום גליה יכולות לשמש כדי לחקור שינויים ברגישות presynaptic, פעילות postsynaptic, נפח חלל חוץ תאי ויכולות חציצת אשלגן 6, 8. הנוכחי טרנספורטר גלוטמט astroglial הוא מדד רגיש של שחרור גלוטמט presynaptic, מסוגל לעקוב אחר שינויים בטווח קצר בהסתברות השחרור 3, 5, 9. יתר על כן זה יכול לשמש כדי לאפיין את האינטראקציות הפונקציונליות סינפסה-גליה בסינפסות שונות או בst התפתחותית השונהגילי 10. זה צריך להיות מודגש שGLTs הם מאוד טמפרטורת 11 רגישות ומונעים על ידי אלקטרוכימי השיפוע של Na +, K + ו-H +12. כך משרעת וקינטיקה של זרם GLT מאוד תלויה בתנאי הניסוי שנבחר. יתר על כן, כמובן הזמן הממשי של פינוי גלוטמט astroglial נגזר מהנוכחי GLT המוקלט ידוע שמוסתרים בהחלק. זאת בשל הסינון של זרמי GLT ידי גורמים כגון מאפייני electrotonic של האסטרוציטים או שחרור המשדר אסינכרוני, המעוותים קינטיקה שלהם 13. שיטות חילוץ התכונות הזמניות של מנגנוני הסינון פותחו וניתן להשתמש בו כדי להפיק את מהלך זמן שחרור גלוטמט בפועל במצבים פיסיולוגיים או פתולוגי, כפי שמתבצעות 6,13,14 recenly. בנוסף, הקלטה בו הזמנית של שלילת קוטביות קרום astroglial, במהדק נוכחי, יכולה לספק insigHTS לשינויים אפשריים של הארעיים אשלגן תאיים. האסטרוציטים יחידים לפנות עד 100.000 סינפסות של ~ 100 נוירונים שונים, ולכן אין לשלב ולווסת את הפעילות של רשתות עצביות מקומיות.
בעת השימוש בטכניקה שהוצג כאן כלומר תגובות, הקלטת אלקטרו כל תאים מהאסטרוציטים להבנה טובה של פעילות הסינפטית בסיס, יש לזכור כי בהאסטרוציטים, קלטות תיקון-מהדק ברמת סומה לאפשר זיהוי זרמים בעיקר מקורם סומה התא או תהליכים הפרוקסימלי. אכן, זרמים שזוהו באופן חלקי בלבד סומה מקורן תהליכי דיסטלי עדינים כאשר הפעלה חזקה של קולטני וערוצים המתחוללים בתהליכים עדינים מרובים יכולה ליצור זרמים מתפשטים לסומה התא. כך הקולטן בסיס ופעילות ערוץ בתהליכי astroglial קטנים בודדים מכסים תאים סינפטיים הוא כמעט לא מורגש. זה נובע בחלקו המוגבל ירקשליטת IAL והזמני של זרמים ומתחים על ידי קרום הקלטות תיקון-מהדק כל תאים מהאסטרוציטים באתרם. עם זאת, יש לציין כי על פני השטח של תהליכי astrocytic זעירי השפע עולים בהרבה את שטח הממברנה של תהליכי soma והעיקרי. בנוסף, microdomains astroglial perisynaptic אלה מכילים קולטנים התפקודיים הרלוונטיים וערוצים, שעשוי לשחק תפקיד חשוב בתקשורת ורגולציה neuroglial הסינפטי. הטכניקה שהצגנו כאן היא אפוא בעיקר כדאי ללמוד את אינטגרצית astrocytic פעילות סינכרוני מהרכבים עצביים, המתרחש בעיקר בזמן גירוי afference. זה לא צריך לשמש כדי לחקור את הדיאלוג בין סינפסות בודדות ותהליכי astrocytic עדינים סמוכים שאירעו במהלך פעילות ספונטנית בסיס. שיטה חלופית ללמוד תגובות astroglial מקומיות הנגרמות על ידי פעילות הסינפטית בסיסית תהיה לבצע הקלטות תיקון-מהדקת מתהליכים עדינים, כמו דאחד בדנדריטים 15. למרות תיקון תהליכי astroglial נאים אלה עשוי מאתגר בשל גודלם הקטן, זה כנראה שדרה להמשיך לפענח שיח אינטימי יותר בין microdomains astroglial וסינפסות הבודדה. עם זאת, התגובות העשויים הקטנות אלקטרופזיולוגים astroglial הנובעות מתהליכי astroglial עדינים בודדים יכולות להיות מתחת לסף גילוי, שכן רעש חשמלי מגיע בממוצע 3-5 הרשות הפלסטינית בהקלטות תיקון-מהדקת. שיטה נוספת ללמוד תגובות astroglial לפעילות הסינפטית היא הדמית סידן, שכן הפעלה של רצפטורים astrocytic ממברנה או על ידי מובילי חומרי neuroactive יכולה לעורר ארעית הסידן תאי. עם זאת, טוען בתפזורת של האסטרוציטים עם אינדיקטורים סיד עשוי גם לשקף בעיקר פעילות גופנית 16. שילוב של הדמית electrophysiology וסידן גם מאפשר גילוי אותות סידן קטנים מתהליכי astroglial עדינים, או המתרחש באופן ספונטני או מופעל בגירוי מינימאלי y הסינפטי 17, 18. עם זאת, יש לזכור שמדדים בסידן זיקה גבוהה עלולים לפעול כמו מאגרי הסידן, שבילי הסידן חשוב עיכוב איתות, ואילו אינדיקטורים-זיקה נמוכה יכולים לעבוד מתחת לרמת גילוי. לבסוף, טכניקה אלגנטית ולא פולשנית ללמוד אירועי סידן בתהליכי astrocytic משובחים, אשר גם עוקף את הסחף של מולקולות איתות תאיות במהלך תיקון-מהדק כל התאים, כוללת בשימוש בחיישן קרום ממוקד סידן, אשר יכול לבוא לידי ביטוי בהאסטרוציטים באתר, כמו גם in vivo 19. עם זאת, הדמית סידן יכולה לספק רק מידע על מולקולה אחת איתות, מעורבת ברבים, אך לא את כל הפעילות הסלולר, ואילו תיקון-מהדק כל התא מספק מידע כמוני על כל הזרמים היוניים השונים שהופעלו על ערוץ והפעלה קולטנית. הקלטות אלקטרו לכן בו זמנית מתאי עצב והאסטרוציטיםהם שיטה ייחודית ורב עצמה כדי לפענח מקוון הדינמיקה של איתות יונית neuroglial ועיבוד המידע במוח את תפקידה.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לדנה Kamalidenova, מורגן Autexier, ורוש Chopier, שעשה את הווידאו ואנימציות, כמו גם פלוריאן בק לצילומים ולאחר הייצור של וידאו קריינות. עבודה זו מומנה על ידי אולימפוס ונתמך על ידי מענקים מHFSPO (פרס פיתוח קריירה), ANR (תכנית Jeunes chercheurs והתכנית בלאן Neurosciences), FRC (הפדרציה pour la המשוכלל והנדיר sur le Cerveau), ולה INSERM Pitié Salpêtrière החולים (מחקר Translational חוזה) לע"נ, ממלגות Forschungsgemeinschaft דויטשה פוסט דוקטורט הצרפתי למחקר ולמשרד, ומן "גבולות במדעי חיים" בבתי הספר דוקטורט, פריז דידרו אוניברסיטה, טנקור ולר קרן, וFRM (Fondation pour la המשוכלל והנדיר Médicale) דוקטורט לי.ס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C.
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al.
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
