Summary
절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의 준비
Abstract
Astrocytes들은 통합 곳, 뉴런 삼자 간의 시냅스와 함께 형성하고 neuronal 활동을 조절. 사실, astrocytes는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 활성화를 통해 neuronal 입력을 감지하고, gliotransmitters의 활동에 의존 출시를 통해 일부 프로세스 정보를 제공합니다. 또한, astrocytes는 glutamate의 기본 이해 시스템을 구성, 칼륨 공간 버퍼링에 기여뿐만 아니라 GABA 통관에 있습니다. 이러한 세포는 따라서 지속적으로 시냅스 활동을 모니터링하고, synaptically 출시 glutamate의 변경, GABA 및 세포 칼륨 수준에이를 민감한 지표입니다. 또한, astroglial 이해 활동이나 버퍼링 용량의 변경이 neuronal 기능에 심각한 영향을 미칠 수 있으며, physiopathological 상황 또는 녹아웃 마우스를 특성화 할 때 간과 될 수 있습니다. neuronal 및 astroglial 활동의 듀얼 녹화 따라서에서 변경을 연구하는 중요한 방법입니다시냅스 강도가 astroglial 이해와 버퍼링 용량의 변화를 수반하는 연관. 여기 hippocampal 슬라이스, 어떻게 지층 radiatum의 astrocytes을 식별하는 방법과 동시에 neuronal 및 astroglial electrophysiological 응답을 기록하는 방법을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 pharmacologically synaptically-evoked astroglial 전류를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 인공 뇌척수 및 세포 솔루션의 준비
- 실험을 시작하기 전에, 하나는 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 해마 준비를위한 인공 뇌척수 (ACSF)에 대한 내부 솔루션을 준비해야합니다. 유리 가스 발생 장치 (마이크로 필터 촛불, ROBU 독일) 및 조직 그리드 (모기 그물이나 나일론 꼭), 당신은 또한 외과 가위, 고급 홍채 가위, 두 spatulas와 포셉 (정밀 과학 도구)로 구성된 분해 키트가 필요합니다 뿐만 아니라 superglue (Uhu 덴트). 전기 생리학 슬라이스 패치 설치의 구성 Finkel & 닐, 2001 년 1 설명했다.
- 내부 솔루션 (MM)을 용해 : 105 K-글루 콘산, 30 KCl, 탈 이온수 10 HEPES 및 0.3 EGTA (최종 볼륨 70-80%에서). 4 ° C에 솔루션을 시원하고 (MM)을 추가 : 4 ATP-MG, 0.3 GTP-트리스 10 phosphocreatine. 코와 채우기 U와 함께 7.4으로 pH를 조정최종 볼륨에 탈 이온수와 P. (Osmolaritiy : ~ 280 mOsm). 이 솔루션 (기공 크기 0.2 μm)를 필터링 할 수 있습니다. Aliquoted 솔루션에 3~4주에 대한 안정 - 20 ° C. 한 실험 일 경우, 내부 솔루션의 ~ 1 ML이 필요합니다.
- 별도로 명시되지 않는 한, CA1 지역에서 해마의 준비와 세포의 녹음에 사용되는 ACSF은 (MM)을 포함하고 : 119 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgSO 4, 아니 2 PO 4, 26.2 NaHCO 3, 11 포도당. carbogen (95% O 2 5 % CO 2)에 - 적어도 10 분 (7.4 산도 ~ 7.3)를위한 탈 이온수 (Osmolarity ~ 320 mOsm)과 산소를이 솔루션에서 이러한 염을 분해. 실험 당 솔루션의 이상 1리터를 준비합니다. 특히주의 해마의 CA3 영역에서 실험을 수행하는 데 사용됩니다 hippocampal 조직의 준비를 위해주의해야한다. 사실,이 지역은 활동과 이후 neuronal 죽음을 epileptiform하는 경향이 있습니다. 따라서 synapt87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 아냐 2 PO 4 : 포함 된 얼음처럼 차가운 자당 솔루션에서 해마의 절개를 (MM)를 수행하여 IC 활동이 강력하게 슬라이스 준비하는 동안 감소해야하고, 이것은 달성 , 25 NaHCO 3, 10 혈당 75 자당. 이 솔루션에서, 낮은 나트륨, 낮은 칼슘, 높은 마그네슘 농도의 조합은 대량 따라서 자연 활동과 세포 사망을 최소화 presynaptic 발사 및 출시 확률뿐만 아니라, postsynaptic 수용체 NMDA 활동을 줄일 수 있습니다. CA3 지역에서 세포의 녹음에 사용되면 준비, hippocampal 슬라이스는 polysynaptic 활동을 최소화하기 위해 4 MM CaCl 2, MgSO 4 4, 포함 수정 ACSF와 perfused 있습니다.
2. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비
- 지속적으로 oxygenating 동안 ~ 300 썰기 챔버에 대한 ACSF의 ML뿐만 아니라, 4 ° C에서 준비 다운 쿨carbogen. 또한 carbogen (구성표 그림 1)과 산소를합니다 슬라이스 스토리지, 동안 실온 (RT)에 ACSF에 작은 비커를 준비합니다.
- 케이지에 추가됩니다 한 ML의 isoflurane로 적셔 작은 종이 타월로 후드 아래에 마우스를 마취.
- 마우스를 깊이 anesthetized되면 머리를 잘라서 얼음처럼 차가운 산소를 ACSF과 함께 작은 그릇에 직접 추가 할 수 있습니다. 작은 가위로 두피를 제거하고 다음 단계에 조직 위에 머리를 전송할 수 있습니다. 그림과 그림 1에 설명 된대로, 해마를 해부하기 시작합니다.
- 얼음처럼 차가워에서 저속 (3 μm / 초) 70 Hz의 진동 주파수에서 300-400 μm 두께의 가로 조각을 잘라 ACSF을 산소 및 저장 칸으로도 양도 할 수 없습니다. 최소 1 시간 전에 녹화 RT의 조각을 방치 했죠. CA3 실험에 대한 슬라이스는 34 ° C에서 25 분을 저장하고 RT 적어도 30 분은 썰기 과정에서 복구 할 수 있습니다. 3. Evoked Astroglial 전류와 Neuronal 필드 후보들의 듀얼 녹화
- 지속적으로 흥분성의 반응을 분리하기 위해 100 μM의 picrotoxin을 (GABA 길항제) 포함 산소 ACSF (1.5-2 ML / 분, RT)으로 녹음 챔버를 perfuse. 폴리-L-라이신 (1.5-3 MG / ML) 코팅 coverslip에 조각을 전송, 좋은 슬라이스 접착력을 달성하기 위해 액체를 담그고하며 슬라이스 위에 ASCF 한 방울을 추가합니다. 녹음 챔버에 coverslip를 놓습니다. picrotoxin에 의한 억제 전송 봉쇄는 epileptiform 활동에 evoked 이벤트의 측정을 왜곡 할 neuronal 인구의 예 자연, 동기 사격을 발생할 수 있습니다. 따라서, epileptiform 활동을 방지하기 위해,을CA1과 CA3 지역 사이의 평면 절단 (표면 만)은 Schaffer 민간인 피해 (그림 2A에 표시된)를 통해 전파되지 않도록 할 수 있습니다.
- 지층 radiatum의 astrocytes들은 작은 소마 크기 (~ 10 μm)와 별 모양의 프로세스 어셈블리로 식별 할 수 있습니다. 적어도 20-30 μm 슬라이스 표면 아래 셀을 선택합니다. 자극 격리 상자에 연결되어 목욕탕 (단순히 유리 피펫 주위에 두 번째 실버 와이어를 배치하여)에 접지되어있는 은색 선에 유리 자극 전극 (팁 저항 MΩ ~ 1) 탑재합니다. Schaffer의 담보 지역에 자극 전극을 놓고, 같은 거리에 선택한 astrocyte 200-300 μm의 거리에서 그림 2A에 표시된. 앰프의 headstage에 연결된 염화 실버 와이어로 필드 레코딩 전극 (MΩ ~ 2-5) 탑재합니다. 두 전극은 ACSF과 전에 채워집니다. 외부 COM을 사용할 수 없게 나는 = 0 모드를 multiclamp에서 선택mand 입력 및 ~ 50 μm 떨어진 지층 radiatum 지역 (그림 2A)로 astrocyte의 전극을 배치합니다. 게인 2-10과 2 kHz에서 베셀 필터 필터와 응답을 기록합니다. 뇌 슬라이스로 전류 주입은 presynaptic 터미널에서 주변 Schaffer의 부수적 인 axons와 후속 송신기 릴리스에서 작업 잠재력을 실행 해당 프로젝트 postsynaptic CA1 피라미드 뉴런합니다. 출시 송신기는 작은 부정적인 잠재적으로 extracellularly 측정합니다 postsynaptic ionotropic 수용체를 통해 세포에 긍정적 인 충전 흐름을, 실행됩니다. 억제 전송이 pharmacologically 차단되는 동안이 필드는 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (fEPSP)는 동시에 활성화 뉴런의 그룹의 활동을 통합합니다. fEPSP를 그대로 보여주고하려면 몇 가지 테스트 펄스를 (0.1 밀리 초 시간)를 적용하고, 자극 전극의 일부 재배치는 fEPSP를 높이는 데 도움이 있습니다. 전형적인 CA1 지층 radiat음 ... fEPSP는 그림 2B에 도시된다. 위치 및 응답 파형에 대한 자세한 내용은 원 외에서 찾을 수 있습니다. 2,003 2. 건강한 hippocampal 슬라이스의 fEPSP 진폭은 일반적으로 섬유 발리의 진폭보다 두 배나 큰 이상이어야합니다. fEPSP 진폭 또는 기울기의 정확한 정량화를 들어, evoked reponse는 polysynaptic 활동으로 (다중 피크 응답으로 감지) 시냅스 활동이 hyperexcitability에 표시 될 수있는 전기 자극의 독립을 나타냅니다 monosynaptic해야합니다. 그림 3C에 도시 된 바와 같이 해마의 CA3 영역에서 수행 실험 자극 및 녹화 피펫이 위치하고 있습니다. 분명 몇 초 동안 이끼 섬유 강력하게 촉진 아르 입력, 쌍 - 펄스 자극 (50 밀리 초 interpulse 간격) 및 1 Hz에서의 자극을 식별하려면 매우 fEPSP responses.At에게 끝을 evoked 처음 낮은 진폭을 강화하기 위해 적용되는실험 DCGIV, mGluR2 / 3 수용체 길항제는 더 이상 참 이끼 섬유 입력이 자극되어 있는지 확인하기로 세탁 할 수의. 이 길항제의 응용 프로그램 mGluR2 / 3 수용체, 이끼 섬유 boutons에서 억제 presynaptic 릴리스의 높은 표현으로 인해 ~ 90 %로 fEPSP을 감소해야합니다.
- 필터링 내부 솔루션과 패치 피펫을 (MΩ ~ 2-5)를 입력하고 두 번째 headstage에 연결된 염화 실버 와이어로를 탑재하여 피펫 홀더에 튜브를 통해 연결되어있는 주사기와 긍정적 인 압력을 적용 할 수 있습니다. 지속적으로 10 mV의 20 밀리 초 테스트 펄스를 적용하고 세포 표면에 도달하고 막에 편향이 표시 될 때까지 조직에 피펫 이동합니다. 오프셋 피펫을 제로, 긍정적 인 압력을 제거하고에 막 클램프 - 80 뮤직 비디오. gigaseal (최소 1 GΩ) (그 몇 초보다 더 오래 걸릴하지 않아야 함)에 도달 할 때까지 기다립니다. 일부 부정적인 압력을 부드럽게 응용 프로그램은 AG에 도달하는 데 도움이 될igaseal. 세포에 침입하는 것은 부정적인 압력의 짧은 응용 프로그램에 의해 달성 multiclamp에서 적의 공격 기능을 사용하고 있습니다. fEPSP 및 전압 클램프의 astroglial 응답을 (-, 주파수 0.1 Hz에서, 베셀 필터 2 kHz에서, 게인 10 80 뮤직 비디오 Vhold) evoked Schaffer의 담보의 동시 녹음을 시작합니다. 당신이 인접 피라미드 세포에 의해 생성 된 fEPSPs을 반영, 빠른 과도 외부 전류를 볼 수 있습니다 첫째 : astroglial 현재 반응은 biphasic입니다. 이것은 천천히 상승 썩어 가고있는 내향 전류 (neuronal 반응이 종료 된 후에도 지속 몇 초 (> 10 초))을합니다. 이 전류는 depolarized postsynaptic 터미널 주변의 출시에 따라, astrocytes에 칼륨 항목 주로 때문입니다. presynaptic glutamate 자료에 의해 트리거 전류를 동시에 활성화 빠른 과도 glutamate의 전송 (GLT)은 칼륨 전류에 의해 마스크됩니다. astrocyte뿐만 아니라 패치의 액세스 저항의 개최 가능성은 MO해야실험을하는 동안 nitored 및 녹화 조건의 변화로 인해 astroglial reponses의 부정확 한 모니터링을 방지하기 위해, ~ 20 % 이상을 변경할 수 없습니다. 초기 지주 가능성> -70 뮤직 비디오 만 astrocytes는 건강한 세포를 연구 조사해야합니다.
- evoked astrocytic 막 탈분극을 기록하기 위해 전압에서 전류 클램프로 전환합니다. fEPSP이 완전히 차단되고 GLT 진폭이 대지에 도달 할 때까지, ionotropic의 glutamate 수용체 차단 kynurenic 산 (5 ㎜)의 재관류에 의해 glial glutamate의 전송 (GLT)는 현재 분리합니다. 명확하게 GLT 전류를 확인하려면 특정 길항제 DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic 산 (DL-TBOA, 200 μM)를 적용 할 수 있습니다. 다른 시냅스 강도에 neuronal 및 astroglial 반응을 기록, 페어링 된 펄스 자극에 대한 응답을 조사하는 두 밀접하게 이격 된 자극을 (50 밀리 초 간격) 적용하기 위해 5 배에서 2 배하여 자극의 강도를 높입니다. 시리즈 R의 안정성glial 세포의 esistance와 막 잠재력은 녹화 내내 모니터링해야합니다.
- 갭 접합의 범위는 astroglial 네트워크를 중재 시각화하기 위해 염료 커플 링 실험 등 sulforhodamine-B의 낮은 분자 염료 (<1.5 kDa)의 수동적 확산을 사용하려면, 모든 현재 분사하지 않고, 현재 클램프 모드에서 수행해야 간격 접합 채널을 통해. 주변 조직에 염료가 모자라 방송을 최소화하기 위해, 조직을 입력 만하면 긍정적 인 압력이 패치 피펫을 통해 적용해야하고 패치는 가능한 한 빨리 도달해야합니다.
우리는 여기서 세포 전극을 사용하여 afference의 자극을 통해 시냅스 활성에 의해 유도 astroglial와 neuronal 반응, 즉 반응을 synaptically-evoked 기록하는 방법에 대해 설명합니다.
Representative Results
해마의 CA1 지역에서 synaptically-evoked astroglial와 neuronal 응답의 대표 동시 녹음 (fEPSPs)는 그림 2 AB에 표시됩니다. evoked astroglial 전류는 biphasic입니다, 즉이 과도 외부 전류 및 (그림 2B) (> 10 초) 천천히 부패 안쪽 현재 구성되어 있습니다. 외부 전류는 evoked fEPSP을 반영하고, kynurenic 산 (짙은 회색 추적, 그림 2B) (3)에 의해 ionotropic의 glutamate 수용체의 억제 후 차단됩니다. 이 또한 주를 대표하는 것으로 알려진 postsynaptic ionotropic의 glutamate 수용체의 활동을 억제하는 kynurenic 산, (그림 2B 및 그림 2C 1) 3-6으로 폐지되기 때문에 속도가 느린 안쪽 현재의 대부분은 astrocyte 다음과 postsynaptic 탈분극에 칼륨 항목을 반영 칼륨 출시 7 소스 (80 %). 나머지는 빠른 속도로 상승D 부패 안쪽으로 전류가 GLT 길항제 DL-TBOA (밝은 회색 추적, 그림 2B 및 그림 2C 2)에 의해 저해된다. kynurenic 산 (짙은 회색 추적)에서 현재의 TBOA (밝은 회색 추적)에서 나머지 느린 전류의 후 임시 빼기는 현재 순수 astroglial glutamate의 전송 (흑백 추적)의 분리는 그림 2C 2에 도시 할 수 있습니다. 지속적인 천천히 kynurenic 산에서 현재의 부패와 TBOA은 (밝은 회색 추적, 그림 2B 및 그림 2C 2) TTX (데이터 미도시)에 의해 차단하고, 가능성이 가장 높은 세포 K의 축적을 반영 + presynaptic 수입 성의 사격 3에서 릴리스 할 수 있습니다. Schaffer 민간인 피해의 보통 하나의 자극은 동일한 세포 (그림 2D)에 기록 된 작은 evoked 탈분극에 비해 상대적으로 큰 synaptically-evoked astroglial 전류를 유도한다. 이것은 때문입니다astrocytes의 낮은 막 저항. synaptically-evoked astroglial 막전위 역학의 녹음, 그림 2D에 도시 된 바와 같이, 지역 세포 칼륨 수준 8 직접적으로 측정 한 것입니다. 기본 neuronal 활동 evoked astroglial 응답 정상화 다른 실험의 직접적인 비교 등 최근 6 표시 할 수 있습니다. 총 synaptically-evoked astroglial 전류 선형 fEPSP의 증가 (그림 2E)을 다음과 같이 Astroglial 전류은 또한 매우 안정적으로 흥분성의 전송에 변경을 모니터링 할 수 있습니다. 사람들이 보여 이후 Astroglial 전류 또한, 단기 시냅스 소성을 반영, 뉴런 등, 짝 펄스 촉진 (그림 2F). CA1 피라미드 세포와 astrocyte의 짝을 전체 셀 녹음, depolarizing 펄스에 대한 응답으로 뉴런 표시 행동 잠재력 때문에, 두 세포 유형에 매우 다른 electrophysiological 동작을 보여인근 astrocyte는 (그림 3A-B) 자동에 있습니다. 그러나, Schaffer 민간인 피해의 적당한 자극을 동시에 CA1 피라미드 세포와 인접 astrocyte (그림 3B 2) 빠른 외부와 느린 안쪽으로 전류의 빠른 흥분성의 posynaptic 잠재력을 그대로 보여주고 있습니다. 그림 3C와 같이 synaptically-evoked neuronal 및 astroglial 응답 듀얼 녹음은 또한 해마의 CA3 영역에 기록 할 수 있습니다. 사실, CA3 이끼 섬유의 하나의 자극이 기저 상태에서 astrocytes의 작은 빠른 외측과 내측 느린 전류 (그림 3D 1)에 연결된 로컬 fEPSPs로 기록 아주 작은 neuronal 응답을, 세상의 시작과 끝. 그것은 단지 적당한 astroglial 응답 (그림 3D 2) 증가하면서 대조적으로, 몇 초 동안 CA3 이끼 섬유의 1 Hz에서의 자극은 강하게, fEPSP을 potentiates.
횡단 조각을 준비하는 1. 해마 절연 그림. 뇌를 해부하기 위해 중간 선 (가) 함께 스컬을 잘라. 후각 망울 (B)의 수준과 이후 소뇌 (C)의 수준에서 코로나 몫을합니다. 조심스럽게 집게 (D)의 도움으로 스컬를 제거 블레이드 (전자)와 두 반구를 분리하고 차가운 산소를 ACSF (F)에 작은 스푼에 올려 전송할 수 있습니다. ~ 5 분 평균 한 후, 최대 안쪽 표면 (g)와 마른 조직에 하나의 반구를 넣습니다. 두 스푼의 도움으로 diencephalon (HJ)를 제거하십시오. 점선 (K)에 의해 그림과 같이 해마, 지금은 볼 수 있습니다. 흰색 구조 (LM)과 같은 표시, fimbria부터, 스푼으로 해마를 해부. 추위 ACSF에 다시 해마를 전송합니다. 작은 아가로 오스 블록, alveus 측면이있는 위치에 두 hippocampi을하고 복부 hippocamp 준비우리는 한천 블록의 가장자리를 마주하고, 한천 (N)에 좋은 첨부 파일을 허용하는 거리에주의 깊게 모든 액체를 즐겨보십시오. 접착제 해마는 복부 부분 (O)에 한천 블록에 부착.
그림 2. 해마의 CA1 영역에서 - synaptically evoked 동시 neuronal와 astroglial 응답. A) astrocytic 전류를 기록하는 Schaffer 민간인 피해 (SC), 패치 피펫 전극을 활성화 할 수있는 자극 전극의 배열을 도시 hippocampal 슬라이스, 그리고 세포 전극의 계획은 hippocampal에 SC의 자극에 의해 evoked, fEPSP을 기록하는 CA1 공간이 마련되어 있습니다. B) fEPSPs의 동시 녹음 (상단 패널)과 evoked-synaptically presenc에서 SC의 자극에 의해 astrocytic 전류 (낮은 패널)의 대표 흔적약리 약물의 전자. 답변은 먼저 GABA 흥분성의 반응을 분리하는 수용체 차단 (picrotoxin, 100 μM, 검은 흔적)의 존재에 기록됩니다. ionotropic의 glutamate 수용체 차단 (kynurenic 산, 5 음, 짙은 회색 흔적)의 후속 응용 프로그램입니다 astrocytic 현재 응답의 작고 빠른 과도 구성 요소를, unmasking, fEPSP과 오래 지속 astroglial 현재의 주요 부분을 억제 glutamate 전송 차단 (TBOA, 200 μM, 밝은 회색 흔적)에 민감. 규모 바, fEPSP 0.1 MV, astrocytic 현재 15 PA, 10 밀리 초. C 1). 총 전류에서 kynurenic 산 (2)에 남아있는 현재 구성 요소를 차감하여 B (하단 패널, 검은 색 추적)에 표시된 evoked 응답에서 격리 할 수 있습니다 현재 astroglial 칼륨 (1-2)의 샘플 추적 ( 1). 규모 바, 20 파, 1 초. TBOA 물론, 뺄셈 얻은 현재 glutamate 전송 (2-3)의 C 2) 샘플 추적kynurenic 산 (2)에서 현재의 nsensitive 속도가 느린 구성 요소 (3). 규모 바, 2.5 PA, 25 밀리 초. D) 안쪽으로 현재의 샘플 흔적은 전압 클램프 (하단 패널)와 SC의 자극에 의해 astrocyte에서 유도 전류 클램프 (상단 패널)에 기록 된 해당 막 탈분극에 기록. 스케일 바는, 1.5 MV, 전압 클램프 5 파, 1 초에 전류 클램프. E) presynaptic 섬유 연발 (입력) 및 (출력) 총 astroglial 현재 사이의 관계를 설명 입력 - 출력 곡선은 SC의 자극 (N = 6)에 대한 응답으로 동시에 기록했다. neuronal fEPSP으로 선형 증가 섬유 연발있는 astroglial 현재 증가. F) neuronal 응답 (fEPSP)과 astrocytic 현재의 샘플 흔적은 40 밀리 초 interpulse 간격으로 짝 - 펄스 자극에 표시됩니다. synaptically-evoked astroglial 현재 전시 뉴런, 짝 - 펄스 촉진처럼. 규모 바, 0.1 MV, 5 PA, 20 밀리 초.
그림 3. 해마의 CA1과 CA3 영역에서 synaptically 유발 neuronal 및 astroglial 응답 듀얼 레코딩. A) sulforhodamine-B (적색, 0.1 %)과 전체 세포 패치 - 클램프 기법을 사용하여 fluorescein dextran (녹색, 0.1 %)로 가득 astrocyte와 함께 주입 CA1 피라미드 세포의 재건. 스케일 바, 10 μm. B 1) CA1 피라미드 세포와 인접 astrocyte에서 전류 클램프에 기록 된 막 전위의 동시 전체 셀 녹음의 대표 흔적. Neuronal 작업 잠재적 발사 (검은 흔적), 전류 펄스를 depolarizing 20 PA의 주입에 의해 evoked, 인접 astrocyte (회색 추적)에서 응답 세상의 시작과 끝 않습니다. 규모 바, 20 MV, 10 파, 100 밀리 초. 전류 조개의 CA1 피라미드 세포의 이중 전체 셀 녹음의 B 2) 샘플 흔적P와 picrotoxin (100 μM)의 존재에 SC의 자극 후 전압 클램프의 이웃 astrocyte. SC의 자극은 (회색 추적) 작고 오래 지속 astrocytic 현재에 연결 흥분성의 postsynaptic 잠재력을 (EPSP, 검은 흔적), 세상의 시작과 끝. 규모 바, 5 뮤직 비디오, 10 파, 100 밀리 초. C) hippocampal 슬라이스의 제도에 이끼 섬유, 패치 피펫 전극 (회색), astrocytic 전류를 기록하고, 세포 전극을 활성화하려면 이가있는 이랑 (DG)과 CA3 영역 자극 전극의 배열에 묘사 CA3 이끼 섬유의 자극에 의해 evoked 기록 fEPSP. CA3 fEPSPs의 짝을 녹음 (상단 패널, D 1, D 2 블랙 흔적)와 astrocytic 전체 세포 반응 (하단 패널, D 1, D 2 회색 흔적) CA3 이끼의 단일 자극에의 D, E) 대표 흔적 0.02 Hz에서 (삽입 확대) (D 1)에서 또는 1 Hz에서의 자극 주파수 (D 2)의 섬유. D에 대한 스케일 바
Discussion
synaptically - 유도 neuronal와 glial 응답 듀얼 녹화가 astroglial 특성의 변화에 관련된 사전 및 postsynaptic 활동에 온라인으로 변경 공부를 할 수있는 유용한 방법입니다. synaptically-evoked glial 막 탈분극은 세포 칼륨 presynaptic 작업 잠재적 발사에 부분에 의한 상승 8,하지만 대부분 postsynaptic 탈분극 7의 직접 측정 한 것입니다. glial 막전위 역학에 따라서 녹음 presynaptic 흥분의 수정, postsynaptic 활동, 세포 공간 볼륨과 칼륨 버퍼링 용량을 6, 8을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. astroglial glutamate의 전송 전류는 출시 확률 3 단기 변화, 5, 9 모니터 할 수 presynaptic glutamate 자료의 민감한 측정입니다. 그것은 또한 다른 시냅스에서 또는 다른 개발 St에서 기능 시냅스-glia 상호 작용을 특징하는 데 사용할 수 있습니다나이 10. 그것은 GLTs 높은 온도에 민감한 11아르와 그렇단 +, K +와 H 12의 전기 기울기에 의해 구동되는 강조 표시됩니다. 따라서 GLT 전류의 진폭과 반응 속도론은 매우 선택한 실험 조건에 따라 달라집니다. 또한, 기록 된 GLT 전류에서 파생 astroglial glutamate 통관의 실제 시간 코스는 부분적으로 드러나지 것으로 알려져 있습니다. 이 같은 13의 동력학을 왜곡 astrocytes의 electrotonic 속성이나 비동기 송신기 출시 등 요인에 의해 GLT 전류 필터링 때문입니다. 필터링 메커니즘의 시간 기능을 추출 방법들이 개발되었으며 recenly 6,13,14을 수행으로 생리 나 병리 상황에서 실제 glutamate 통관 시간 코스를 도출하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, astroglial 막 탈분극의 동시 녹음, 현재 클램프에 insig 제공 할 수 있습니다세포 칼륨 과도 가능한 변경에 HTS. 싱글 astrocytes는 ~ 100 서로 다른 뉴런의 시냅스 100,000까지 연락, 따라서 통합 않으며 지역 neuronal 네트워크의 활동을 조절.
astrocytes의 방법을 사용하는 것은 여기에 제시된 즉, 녹음 electrophysiological 전체 세포 반응을 기초 시냅스 활동에 대한 인사이트를 얻으려면 하나는 astrocytes에서, 소마 레벨에서 패치 - 클램프 녹음이 검출 전류는 주로 세포 소마에서 발생 할 수 있다는 점에 유의해야합니다 또는 근위 처리합니다. 수용체 여러 고급 과정에서 발생하는 채널의 강력한 활성화는 세포 소마로 확산 전류를 생성 할 수있을 때 사실, 소마에서 감지 전류는 부분적으로 고급 말초 과정에서 발생한. 따라서 신경 구획을 다루는 각각의 작은 astroglial 과정에서 기저 수용체 및 채널 활동은 거의 감지합니다. 이 부분의 제한된로 인해 침을 뱉입니다현장에서 astrocytes에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음에 의한 막 전류와 전압의 ial과 측두엽 제어 할 수 있습니다. 그러나, 풍부한 작은 astrocytic 프로세스의 표면이 소마과 주요 프로세스의 막 면적 훨씬 초과하는 것을인지해야합니다. 또한, 이러한 perisynaptic astroglial microdomains 가능성이 neuroglial 커뮤니케이션과 신경 조절에 중요한 역할을 기능적으로 관련 수용체 및 채널을 포함합니다. 우리가 제시 한 기술은 따라서 afference의 자극에 특정에서 발생, neuronal ensembles의 동기 활동의 astrocytic 통합을 연구하는 대부분 유용합니다. 그것은 기초 자발적인 활동을 통해 발생하는 각각의 시냅스와 인접 고급 astrocytic 프로세스 사이의 대화를 공부하는 데 사용할 수 없습니다. 기초 시냅스 활동에 의해 유도 지역 astroglial 반응을 공부하는 다른 방법은 고급 과정에서 패치 - 클램프 녹음을 수행 할 수와 같은 D 것입니다수석 15 하나입니다. 패치 이러한 고급 astroglial 프로세스가 가능성이 작은 크기로 인해 도전 있지만, 아마 astroglial microdomains 및 개인 시냅스 사이의 더 친밀한 대화 상자를 해명하기 위해 추구 할 수있는 길입니다. 전기 노이즈 패치 - 클램프 녹음에서 평균 3-5 PA에 도달 있기 때문에, 개별 고급 astroglial 과정에서 발생하는 가능성이 작은 electrophysiological astroglial 응답은 임계 값 감지 아래있을 수 있습니다. neuroactive 물질에 의한 astrocytic 막 수용체 또는 수송의 활성화는 세포 내 칼슘 과도를 실행할 수 있기 때문에 시냅스 활동에 astroglial 반응을 연구하는 또 다른 방법은 칼슘 이미징입니다. 그러나, 칼슘 지표와 astrocytes의 대량로드는 주로 체세포의 활동 16이 반영 될 수 있습니다. 전기 생리학과 칼슘 이미징의 조합도 중 B를 자발적으로 발생하거나 발생, 고급 astroglial 과정에서 작은 칼슘 신호를 검출 가능Y 최소한의 신경 자극 17, 18. 그러나, 하나는 낮은 선호도 지표가 감지 레벨 아래에서 사용할 수있는 반면에 높은 친 화성 칼슘 지표, 칼슘 버퍼, 억제 중요한 칼슘 신호 경로처럼 행동 수 있다는 점에 유의해야합니다. 마지막으로, 또한 전체 셀 패치 - 클램프 동안 세포 신호 분자의 유실을 circumvents 고급 astrocytic 과정에서 칼슘 이벤트, 공부 우아하고 비 침습적 기술은 astrocytes로 표현 될 수있는 멤브레인 대상으로 칼슘 센서를 사용하여 구성 현장에서뿐만 아니라 생체 19 있습니다. 전체 세포 패치 - 클램프 채널과 수용체 활성화에 발생하는 모든 다른 이온 전류에 대한 양적 정보를 제공하는 반면 그러나, 칼슘 이미징은 하나의 신호 많은에 관여 분자, 전부는 아니지만 세포의 활동에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 뉴런과 astrocytes에서 따라서 동시 electrophysiological 레코딩neuroglial 이온 신호와 역할 뇌 정보 처리의 역학을 온라인으로 해명 할 수있는 독특하고 강력한 방법입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
작성자는 사진과 음성을 통해 비디오의 사후 생산 다나 Kamalidenova, 모건 Autexier, 그리고 Roch Chopier, 비디오 및 애니메이션을 제작뿐만 아니라, 플로리안 벡 감사드립니다. 이 작품은 올림푸스에서 후원하는 HFSPO (경력 개발 상), ANR (프로그램 Jeunes chercheurs 및 프로그램 블랑 Neurosciences), FRC (연방 뿌린 라 공들인 쉬르 르 Cerveau), INSERM과 라 Pitié Salpêtrière 병원 (병진 연구에서 보조금에 의해 지원되었다 JS로 NR로 계약), 프랑스어 연구 성과 독일 Forschungsgemeinschaft postdoc 휄로 십에서 UP, 그리고 박사 학교 "생명 과학의 프론티어"에서까지, 파리 Diderot 대학, Bettencourt Schuller 기초하고, FRM (Fondation 뿌린 라 공들인 Médicale) 박사 친목
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
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