Summary
إعداد شرائح الدماغ الحادة من الحصين معزولة، فضلا عن التسجيلات في وقت واحد من الخلايا النجمية الكهربية والخلايا العصبية في
Abstract
الخلايا النجمية تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية الثلاثية، حيث أنها تدمج وتعدل نشاط الخلايا العصبية. في الواقع، بمعنى مدخلات الخلايا النجمية العصبية من خلال تفعيل قنواتها أيون والمستقبلات العصبية، ومعالجة المعلومات جزئيا من خلال الإفراج النشاط تعتمد على gliotransmitters. وعلاوة على ذلك، تشكل الخلايا النجمية نظام امتصاص الرئيسي لالغلوتامات، والمساهمة في التخزين المؤقت المكانية البوتاسيوم، وكذلك لإزالة GABA. هذه الخلايا ولذلك نراقب باستمرار النشاط متشابك، وبالتالي هي مؤشرات حساسة للتغيرات في الغلوتامات synaptically صدر، مستويات البوتاسيوم خارج الخلية وGABA. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إحداث تغييرات في نشاط امتصاص astroglial التخزين المؤقت أو القدرة لديهم تأثيرات شديدة على وظائف الخلايا العصبية، ويمكن التغاضي عندما تميز حالات physiopathological أو الفئران خروج المغلوب. تسجيل المزدوج للأنشطة الخلايا العصبية وبالتالي astroglial وسيلة هامة لدراسة التعديلات فيقوة متشابك يرتبط في الأذهان التغيرات في امتصاص astroglial والقدرات التخزين المؤقت. هنا نحن تصف كيفية إعداد شرائح قرن آمون، وكيفية تحديد الخلايا النجمية الطبقة المشععة، وكيفية تسجيل الاستجابات العصبية الكهربية في وقت واحد وastroglial. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف كيفية عزل التيارات عقاقيري synaptically-أثار astroglial.
Protocol
1. إعداد السائل النخاعي الاصطناعي والحل بين الخلايا
- قبل بدء التجربة، ويحتاج المرء لإعداد حل داخلي للتسجيلات المشبك التصحيح، وكذلك السائل المخي الشوكي الاصطناعي (ACSF) لإعداد الحصين. وعلاوة على ذلك سوف تحتاج مجموعة تتكون من مقص التشريح الجراحي وغرامة مقص القزحية، واثنين من ملاعق وملقط (أدوات العلوم الجميلة)؛ جهاز بالغاز الزجاج (الصغرى تصفية شمعة، روبو ألمانيا) وشبكة النسيج (ناموسية أو النايلون ضيق)، وكذلك superglue (فندق Uhu دنت). وقد وصفت تكوين التصحيح الكهربية الإعداد من قبل شريحة وبوكمان فينكل، 2001 1.
- من أجل حل الداخلية، ويحل (مم): 105 K-غلوكونات، 30 بوكل، 10 HEPES وEGTA 0.3 في الماء منزوع الأيونات (في 70-80٪ من الحجم النهائي). تبريد ° C حل ل4 و إضافة (مم): 4 ATP-المغنيسيوم، 0.3-GTP تريس وفسفوكرياتين 10. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع KOH والتعبئة شف مع الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي. (Osmolaritiy: ~ 280 الميلي أسمول). تصفية هذا الحل (0.2 ميكرومتر حجم المسام). الحل Aliquoted ثابت لمدة 3-4 أسابيع في - 20 درجة مئوية. ليوم واحد التجريبية، وهناك حاجة ~ 1 مل من محلول الداخلية.
- ما لم ينص على خلاف ذلك، وتستخدم لإعداد ACSF الحصين والتسجيلات من الخلايا في المنطقة CA1، ويحتوي على (مم): 119 كلوريد الصوديوم، بوكل 2.5، 2.5 CaCl 2، 1،3 MgSO 4، 1 ناه 2 PO 4، 26،2 NaHCO 3 و 11 الجلوكوز. حل هذه الأملاح في الماء منزوع الأيونات (الأسمولية ~ 320 الميلي أسمول) والأوكسجين حل هذه لا يقل عن 10 دقيقة (درجة الحموضة ~ 7،3 حتي 7،4) مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2). إعداد ما لا يقل عن 1 لتر من محلول في التجربة. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لإعداد الأنسجة قرن آمون التي سيتم استخدامها لإجراء التجارب في المنطقة CA3 من قرن آمون. في الواقع، هذه المنطقة معرضة للنشاط صرعي وفاة الخلايا العصبية اللاحقة. synapt بالتاليوينبغي خفض النشاط IC بقوة خلال إعداد شريحة، ويتم تحقيق هذا عن طريق إجراء تشريح الحصين في الجليد الباردة حل السكروز التي تحتوي على (مم): 87 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 0.5 CaCl 2 و 7 MgCl 2، 1 2 PO 4 ناه ، 25 NaHCO 3 و 10 الجلوكوز والسكروز 75. في هذا الحل، فإن الجمع بين الصوديوم منخفضة، تركيزات منخفضة والكالسيوم والمغنيسيوم عالية لحد كبير واحتمال إطلاق الإصدار قبل المشبكي، وكذلك بعد المشبكي مستقبلات NMDA النشاط، مما يقلل النشاط العفوي وموت الخلايا. وperfused المعدة مرة واحدة، وشرائح قرن آمون المستخدمة في التسجيلات من الخلايا من منطقة CA3 مع ACSF معدلة، يحتوي على 4 ملي CaCl 2 و 4 MgSO 4، للحد من نشاط متعدد المشابك.
2. إعداد شريحة الحصين الحاد
- تهدئة مل 300 ~ من ACSF لدائرة تشريح، وكذلك لإعداد C ° 4 في، في حين بالاكسجين باستمرار معكربوجين. إعداد كوب صغير مع ACSF في درجة حرارة الغرفة (RT) لتخزين شريحة التي المؤكسج أيضا مع كربوجين (مخطط الشكل 1).
- تخدير الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع منشفة ورقية صغيرة غارقة مع 1 مل isoflurane التي يتم إضافتها إلى القفص.
- بعد تخدير عميق الماوس، وقطع رأسه قبالة وإضافته مباشرة إلى صحن صغير مع الثلج الباردة ACSF الاوكسيجين. إزالة فروة الرأس مع مقص صغير ونقل رئيس على الأنسجة للخطوات اللاحقة. بدء تشريح الحصين، وكما هو موضح في الشكل 1 صفها.
- قطع 300-400 ميكرون سميكة شرائح عرضية على سرعة منخفضة (3 ميكرون / ثانية) وتواتر الاهتزاز من 70 هرتز في الجليد الباردة المؤكسج ACSF، ونقلها إلى غرفة التخزين. السماح للبقية شرائح RT للتسجيل في ساعة ما لا يقل عن 1 قبل. يتم تخزين شرائح للتجارب CA3 25 دقيقة في C ° 34 و 30 دقيقة على الأقل في RT، للتعافي من عملية تشريح. 3. تسجيل مزدوج من التيارات Astroglial مستدعى والإمكانيات الميدانية العصبية
- يروي باستمرار دائرة تسجيل مع ACSF الاوكسيجين (1،5-2 مل / دقيقة، RT)، التي تحتوي على 100 ميكرومتر بيكروتوكسين (GABA A خصم) لعزل ردود مثير. نقل شريحة الصعود إلى بولي يسين-L-(1،5 حتي 3 ملغ / مل) ساترة المغلفة، نقع السائل لتحقيق التصاق شريحة جيدة وإضافة قطرة من ASCF على رأس شريحة. وضع ساترة إلى غرفة تسجيل. يمكن انتقال العدوى المثبطة الحصار من قبل بيكروتوكسين يؤدي إلى نشاط صرعي، عفوية أي إطلاق متزامن للسكان العصبية، والتي سوف تشوه قياس الأحداث أثار. وهكذا، لمنع نشاط صرعي، وجعلقطع مسطحة (فقط سطح) بين المناطق CA1 وCA3 لمنع انتشار عن طريق الضمانات شيفر (كما هو مبين في الشكل 2A).
- ويمكن تحديد الطبقة المشععة الخلايا النجمية من حجمها الصغير سوما (~ 10 ميكرون) والجمعية النجمية العملية. اختيار الخلية لا يقل عن 20-30 ميكرومتر تحت سطح شريحة. شن القطب التحفيز الزجاج (المقاومة تلميح ~ 1 MΩ) على السلك الفضة متصل إلى الحافز مربع العزلة وترتكز إلى الحمام (ببساطة عن طريق التفاف الأسلاك الفضية الثانية حول ماصة الزجاج). وضع القطب الكهربائي في المنطقة التحفيز ضمانات شيفر، كما هو مبين في الشكل 2A على مسافة من 200-300 ميكرون بعيدا عن نجمية المختار. جبل القطب تسجيل الميدان (2-5 MΩ ~) على سلك الفضة المكلورة متصلة headstage من مكبر للصوت. تمتلئ كل من الأقطاب الكهربائية من قبل مع ACSF. اختيار multiclamp في وضع I = 0، مما يؤدي إلى تعطيل كوم الخارجيةماند المدخلات ووضع القطب الكهربائي ~ 50 ميكرون بعيدا عن نجمية في المنطقة المشععة الطبقة (الشكل 2A). تسجيل الاستجابات مع زيادة 2 حتي 10 وفلتر مع فلتر كيلو هرتز بسل 2. حقن التيار الكهربائي في الدماغ يطلق على شريحة إمكانات العمل في محاور عصبية المحيطة ضمانات شيفر واللاحقة الإفراج الارسال في محطات قبل المشبكي هذا المشروع إلى الخلايا العصبية الهرمية CA1 بعد المشبكي. وأجهزة الإرسال صدر يؤدي الى تدفق شحنة موجبة إلى خلايا المستقبلات من خلال ionotropic بعد المشبكي، التي يمكن قياسها خارج الخلية والمحتملة سلبي الصغيرة. هذا المجال المحتملة بعد المشبكي مثير (fEPSP) يدمج النشاط من مجموعة من الخلايا العصبية نشطة في وقت واحد، في حين تم منع انتقال المثبطة دواء. تطبيق بعض البقول اختبار (0.1 ميللي ثانية مدتها) لتستثير fEPSP، وبعض ضعيتها القطب التحفيز قد تساعد على زيادة fEPSP. نموذجي CA1 الطبقة radiatأم هو موضح في fEPSP 2B الشكل. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول المواقع والطول الموجي في استجابة يوان وآخرون 2003 2. ينبغي أن السعة fEPSP في شريحة الحصين صحية عادة ما تكون أكثر من ضعف كبير مثل السعة وابل من الألياف. لالكمي الدقيق لسعة fEPSP أو المنحدر، ينبغي أن يكون أثار reponse أحادي المشبك، والنشاط متعدد المشابك (للكشف عن استجابة متعددة الذروة) إلى النشاط متشابك مستقلة عن التحفيز الكهربائي، والتي يمكن أن تكون علامة لفرط الاستثارية. لإجراء التجارب في المنطقة CA3 من قرن آمون، يتم وضع التحفيز وماصات تسجيل كما هو موضح في الشكل 3C. أن تحدد بوضوح المدخلات الألياف المطحلب، والتي تسهل بقوة، وإرفاقها بالس التحفيز (50 ميللي ثانية interpulse الفاصل) و 1 هرتز التحفيز لبضع ثوان يتم تطبيقها على نطاق واسع لتعزيز السعة منخفضة في البداية أثار fEPSP responses.At نهايةيمكن أن تغسل من التجربة، DCGIV، ومستقبلات mGluR2 / 3، للتحقق في مزيد من المدخلات التي تم حفز الألياف المطحلب حقا. وينبغي تطبيق هذا الحد من خصم 90٪ من fEPSP ~ بسبب التعبير عالية من mGluR2 / 3 المستقبلات، وإطلاق سراح من قبل المشبكي تثبيط حبات الألياف المطحلب.
- ملء ماصة التصحيح (2-5 ~ MΩ) مع الحل الداخلي التي تمت تصفيتها وتركيبها على سلك الفضة المكلورة متصلة headstage الثاني، تطبيق الضغط الايجابي مع حقنة، وهذا مرتبط عبر أنابيب إلى حامل ماصة الخاص بك. تطبيق اختبار باستمرار ميللي ثانية 20 من 10 نبضة بالسيارات ونقل ماصة في الأنسجة حتى تصل إلى سطح الخلية وانحراف في غشاء تصبح مرئية. صفر ماصة تعويض، وإزالة الضغط الإيجابي، وكبح الغشاء ل- MV 80. الانتظار حتى يتم التوصل gigaseal (على الأقل 1 GΩ) (لا ينبغي أن تستغرق وقتا أطول من عدة ثوان). قد تطبيق لطيف لبعض الضغط السلبي يساعد على التوصل AGigaseal. اقتحام الخلية ويتحقق من قبل تطبيق قصيرة من الضغط السلبي أو باستخدام وظيفة انطلق في multiclamp. بدء التسجيل في وقت واحد للضمانات شيفر أثار fEPSP والرد astroglial في المشبك الجهد (Vhold - 80 بالسيارات؛ زيادة التردد هرتز، كيلوهرتز بسل فلتر 2، 0.1 10). رد astroglial ثنائي الطور الحالي هو: أولا سترى بسرعة الحالية عابرة الخارج، مما يعكس fEPSPs التي تولدها الخلايا الهرمية المجاورة. وتبع ذلك ارتفاع ببطء والمتحللة (ثواني استمرار العديد من (> 10 ثانية) بعد انتهاء الردود العصبية) إلى الداخل الحالية. هذا التيار ويرجع ذلك أساسا إلى إدخال البوتاسيوم داخل الخلايا النجمية، بعد الإفراج من قبل المحطات المحيطة بعد المشبكي استقطابها. وملثمون في وقت واحد سريع تنشيط نقل الغلوتامات عابرة الحالي (GLT)، نجمت عن إطلاق سراح الغلوتامات قبل المشبكي بواسطة التيار البوتاسيوم. يجب أن إمكانية عقد من نجمية، فضلا عن وصول المقاومة من التصحيح يكون موnitored في كافة مراحل التجربة، وينبغي ألا تختلف أكثر من 20٪ ~، لتجنب رصد دقيق من الصياغات astroglial نتيجة للتغيرات في ظروف التسجيل. وينبغي التحقيق في الخلايا النجمية فقط مع إمكانية عقد الأولية> -70 بالسيارات لدراسة الخلايا السليمة.
- التحول من الجهد لفرض الرقابة الحالية من أجل تسجيل أثار إزالة الاستقطاب الغشاء نجمي. عزل نقل الغلوتامات الدبقية (GLT) الحالي عن طريق رذاذ من حامض الغلوتامات ionotropic مانع مستقبلات kynurenic (5 ملم)، حتى يتم حظر الكامل للfEPSP والسعة GLT قد وصلت إلى الهضبة. أن تحدد بوضوح الحالية GLT، تطبيق خصم محددة DL-β-threo-Benzyloxyaspartatic حمض (DL-TBOA، 200 ميكرومتر). زيادة قوة التحفيز من قبل أضعاف أضعاف ل-2-5 لتسجيل الاستجابات العصبية ومتشابك astroglial في قوة مختلفة، وتطبيق اثنين المحفزات المتقاربة (50 ميللي ثانية الفاصل) للتحقيق في الردود على تحفيز نبض المقترنة. استقرار R سلسلةوينبغي رصد esistance وغشاء الخلية من المحتمل الدبقية في جميع أنحاء التسجيل.
- لتصور مدى تقاطع-الفجوة بوساطة شبكات astroglial، ينبغي إجراء تجارب صبغ توصيل في وضع المشبك الحالي، دون أي حقن الحالي، لتمكين نشر السلبي من الأصباغ الجزيئية منخفضة (<1.5 كيلو دالتون)، مثل B-sulforhodamine، من خلال قنوات تقاطع الفجوة. للحد من انتشار صبغة في الأنسجة المحيطة، ينبغي تطبيق الضغط الايجابي من خلال ماصة التصحيح فقط عندما تدخل الأنسجة وينبغي التوصل التصحيح في أقرب وقت ممكن.
نحن هنا تصف كيفية تسجيل synaptically-استجابات astroglial والعصبية، والاستجابات الناجمة عن أي تفعيل المشبك من خلال تحفيز afference باستخدام القطب خارج الخلية.
Representative Results
ويرد التسجيل في وقت واحد ممثل synaptically-استجابات الخلايا العصبية وastroglial (fEPSPs) في منطقة قرن آمون من CA1 في الشكل 2 AB. أثار الحالي astroglial هو ثنائي الطور، أي أنه يتكون تيار عابر الخارج والداخل الحالية المتحللة ببطء (> 10 ثانية) (الشكل 2B). التيار الخارج يعكس أثار fEPSP، ويتم حظر بعد تثبيط مستقبلات الغلوتامات ionotropic من حمض kynurenic (رمادي غامق التتبع، الشكل 2B) 3. غالبية الحالي يعكس بطء الداخل دخول البوتاسيوم إلى إزالة الاستقطاب بعد المشبكي نجمية التالية، حيث يتم أيضا إلغاء من قبل حمض kynurenic، بعد المشبكي مستقبلات الذي يثبط النشاط ionotropic الغلوتامات (2B 2C الشكل والشكل 1) 3-6 و المعروفة لتمثيل الرئيسية المصدر (80٪) من الإفراج البوتاسيوم 7. ما تبقى من الارتفاع السريع لهو تحول دون تدهور د الحالي إلى الداخل من قبل خصم GLT DL-TBOA (رمادي فاتح التتبع، 2B 2C الشكل والشكل 2). خاصة بعد الطرح من التيار البطيء المتبقية في TBOA (رمادي فاتح التتبع) من حمض الحالي في kynurenic (رمادي غامق التتبع) يسمح للعزلة نقل الغلوتامات astroglial نقية الحالية (تتبع أسود)، كما هو موضح في الشكل 2 2C. المتحللة ببطء الثابتة الحالية في حامض kynurenic وTBOA (رمادي فاتح التتبع، 2B 2C الشكل والشكل 2) يمكن حظره من قبل TTX (البيانات لا تظهر)، ويعكس على الأرجح تراكم K + خارج الخلية اطلاق سراح خلال ارد قبل المشبكي 3. التحفيز واحدة معتدلة من الضمانات شيفر يدفع كبيرة نسبيا الحالي astroglial synaptically-أثار بالمقارنة مع إزالة الاستقطاب صغيرة أثار سجلت في نفس الخلية (الشكل 2D). هذا ويرجع ذلك إلىانخفاض المقاومة غشاء الخلايا النجمية. تسجيل من synaptically-أثار astroglial ديناميات المحتملة الغشاء، كما هو موضح في الشكل 2D، هو مقياس مباشر من البوتاسيوم خارج الخلية المستويات المحلية 8. تطبيع أثار ردود astroglial لنشاط الخلايا العصبية الكامنة يسمح للمقارنة مباشرة من التجارب المختلفة، في الآونة الأخيرة كما هو مبين 6. يمكن رصد التيارات Astroglial وعلاوة على ذلك بشكل موثوق جدا تغييرات في انتقال مثير، حيث أن المجموع الحالي astroglial synaptically-أثار يلي خطيا الزيادة في fEPSP (2E الشكل). التيارات Astroglial تعكس أيضا قصيرة الأجل اللدونة متشابك، لأنها تظهر، والخلايا العصبية، وإرفاقها بالس تيسير (الشكل 2F). إقران خلية كاملة تسجيل من خلية نجمية والهرمية CA1 لتكشف السلوك الكهربية مختلفة جدا في كل أنواع الخلايا، لأن العمل إمكانات الخلايا العصبية العرض استجابة لنبض إزالة إستقطاب، في حين أن نجمية المجاورة صامت (الشكل 3A-B). ومع ذلك، يمكن تحفيز معتدل من الضمانات شيفر تثير في وقت واحد سريع المحتملة posynaptic مثير في الخلية الهرمية CA1 وسريع تيارات الداخل إلى الخارج وبطيئة في نجمية مجاورة (الشكل 3B 2). ويمكن أيضا تسجيلات المزدوج للsynaptically-استجابات الخلايا العصبية وastroglial أن تسجل في منطقة CA3 من قرن آمون، كما هو مبين في الشكل 3C. في الواقع، واحدة من التحفيز CA3 الألياف المطحلب تثير ردود القاعدية في ظروف العصبية صغيرة جدا، كما هو مسجل fEPSPs المحلية، المرتبطة الصغيرة تيارات سريعة إلى الداخل إلى الخارج وبطيئة في الخلايا النجمية (الشكل 3D 1). في المقابل، 1 هرتز تحفيز ألياف CA3 المطحلب لبضع ثوان يقوي بقوة fEPSP، في حين أنها معتدلة فقط يزيد من استجابة astroglial (الشكل 3D 2).
رقيقة الصفحة = "دائما"> 
الشكل 1. العزلة الحصين لإعداد شرائح مستعرضة. لتشريح الدماغ، وقطع سكل على طول خط الوسط (أ). جعل خفض الاكليلية على مستوى البصلة الشمية (ب) وبعد ذلك على مستوى المخيخ (ج). إزالة بعناية سكل مع مساعدة من ملقط (د)، فصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة (ه)، ونقلها على ملعقة صغيرة في ACSF الاوكسيجين الباردة (و). بعد موازنة دقيقة ~ 5، مكان واحد نصف الكرة على الأنسجة الجافة مع السطح الإنسي حتى (ز). مع بمساعدة اثنين من ملاعق إزالة الدماغ البيني (HJ). الحصين مرئيا الآن، كما يتضح من الخطوط المتقطعة (ك). تشريح الحصين مع ملعقة بها، بدءا من الخمل وظاهرة للعيان وبنية بيضاء (LM). نقل مرة أخرى إلى الحصين ACSF الباردة. إعداد الاغاروز صغيرة لبنة، ضع الحصين اثنين مع الجانب شكوة حتى وhippocamp بطنيلنا تواجه حافة كتلة أجار، ونقع جميع السائل بعناية بعيدا للسماح مرفق جيدة للأجار (ن). الغراء الحصين تعلق على كتلة أجار على الجزء البطني (س).
الشكل 2. في وقت واحد والردود العصبية astroglial أثار-synaptically في المنطقة CA1 من الحصين. A) مخطط شريحة الحصين توضح ترتيب القطب محفزة، لتفعيل الضمانات شيفر (SC)، والقطب ماصة التصحيح، لتسجيل التيارات نجمي، والقطب خارج الخلية، لتسجيل fEPSP، التي حركها التحفيز SC في قرن آمون CA1 المنطقة. B) آثار الممثل التسجيلات في وقت واحد من fEPSPs (اللوحة العليا) والتيارات نجمي (اللوحة السفلى) أثار-SC synaptically من التحفيز في presenc(ه) من المخدرات الدوائية. وتسجل لأول مرة في الردود وجود مستقبلات GABA A مانع (بيكروتوكسين، 100 ميكرومتر، آثار السوداء) لعزل ردود مثير. الطلب اللاحق من مستقبلات الغلوتامات مانع ionotropic (حمض kynurenic، 5 مم، آثار الرمادي الداكن)، ويحول دون fEPSP والجزء الأكبر من التيار طويلة الأمد astroglial، فضح مكون صغيرة وسريعة عابرة استجابة الحالية نجمي، الذي هو حساسة لنقل مانع الغلوتامات (TBOA، 200 ميكرومتر، آثار رمادي فاتح). مقياس بار، fEPSP 0،1 بالسيارات، نجمي السلطة الفلسطينية الحالي 15 و 10 ميللي ثانية. C 1). تتبع عينة من البوتاسيوم astroglial الحالي (1-2)، والتي يمكن أن تكون معزولة عن الاستجابة أثار، كما هو موضح في B (اللوحة السفلى، أسود التتبع)، وذلك بطرح عنصر الحالية المتبقية في حمض kynurenic (2) من إجمالي الحالية ( 1). مقياس بار، و 20 PA، 1 ثانية. C 2) تتبع عينة من نقل الغلوتامات الحالي (2-3)، التي حصلت عليها من الطرح الأول TBOA بطء مكون nsensitive (3) من حمض الحالي في kynurenic (2). مقياس بار، و 2.5 السلطة الفلسطينية، 25 ميللي ثانية. D) عينة من آثار تيار الداخل سجلت في المشبك الجهد (اللوحة السفلى) وإزالة الاستقطاب الغشاء المقابلة المسجلة في فرض الرقابة الحالية (اللوحة العليا) التي يسببها في نجمية من التحفيز SC. شريط النطاق، المشبك الجاري 1،5 بالسيارات، الجهد المشبك 5 السلطة الفلسطينية، 1 ثانية. E) سجلت المدخلات والمخرجات يوضح منحنيات العلاقة بين ابلا الألياف قبل المشبكي (المدخلات) والتيار مجموع astroglial (الإخراج) في وقت واحد ردا على التحفيز SC (ن = 6). الزيادات الحالية astroglial خطيا مع زيادة الألياف ابلا، كما fEPSP العصبية. F) وترد عينة من آثار الاستجابة العصبية (fEPSP) والتيار نجمي لتقرن بالس التحفيز في فترة 40 ميللي ثانية interpulse. وأثار synaptically-المعارض الحالية astroglial، مثل الخلايا العصبية تيسير تقرن بالس. مقياس بار، 0.1 بالسيارات، 5 السلطة الفلسطينية، 20 ميللي ثانية.
الصفحة = "دائما"> 
الشكل 3. التسجيلات المزدوجة من synaptically التي يسببها استجابات الخلايا العصبية وastroglial في المناطق CA1 وCA3 من قرن آمون. A) إعادة بناء خلية الهرمية CA1 حقن sulforhodamine-B (أحمر، 0.1٪)، ونجمية مليئة ديكستران فلوريسئين (أخضر، 0.1٪)، وذلك باستخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك التقنية. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. B 1) آثار الممثل التسجيلات خلية كاملة في وقت واحد من إمكانات غشاء المسجلة في فرض الرقابة الحالية من خلية الهرمية CA1 ونجمية المجاورة. إطلاق إمكانات العمل العصبية (أسود التتبع)، أثار عن طريق الحقن لإزالة إستقطاب PA 20 نبضة الحالية، تثير أي رد في نجمية مجاورة (رمادي التتبع). مقياس بار، و 20 بالسيارات، 10 باسكال، 100 ميللي ثانية. آثار عينة B 2) من تسجيلات خلية كاملة المزدوج للخلية الهرمية CA1 في البطلينوس المتداولةف ونجمية المجاورة في المشبك الجهد بعد التحفيز SC في وجود بيكروتوكسين (100 ميكرومتر). SC التحفيز تثير إمكانات مثير بعد المشبكي (الكامن الاستثاري بعد المشبكي، أسود التتبع)، ويرتبط إلى تيار صغير نجمي وطويلة الأمد (رمادي التتبع). مقياس بار، 5 بالسيارات، 10 باسكال، 100 ميللي ثانية. C) مخطط شريحة الحصين تصور في التلفيف المسنن (DG) والمناطق CA3 ترتيب القطب محفزة، لتنشيط ألياف المطحلب، القطب ماصة التصحيح (الرمادي)، لتسجيل التيارات نجمي، والقطب خارج الخلية، إلى سجل fEPSP، التي حركها CA3 تحفيز ألياف المطحلب. آثار الممثل D، E) إقران التسجيلات من CA3 fEPSPs (لوحات العليا، آثار سوداء في D 1 و D 2) ونجمي خلية كاملة الردود (أقل ألواح آثار الرمادية في D 1 و D 2) لتحفيز واحد من المطحلب CA3 الألياف عند 0.02 هرتز (تقريب أقحم في) (D 1) أو على التردد 1 هرتز التحفيز (D 2). شريط لنطاق D
Discussion
تسجيل المزدوج للsynaptically التي يسببها استجابات الخلايا العصبية والدبقية هو وسيلة مفيدة لدراسة التعديلات عبر الإنترنت في أنشطة ما قبل وبعد المشبكي المرتبطة التغييرات في خصائص astroglial. وأثار-synaptically إزالة الاستقطاب الغشاء الدبقية هو مقياس مباشر من ارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية 8، ويرجع ذلك جزئيا إلى العمل قبل المشبكي اطلاق المحتملة، ولكن في الغالب لإزالة الاستقطاب بعد المشبكي 7. ويمكن استخدام تسجيلات لذلك من المحتمل الدبقية ديناميات غشاء للتحقيق في استثارة التعديلات قبل المشبكي، والنشاط بعد المشبكي، خارج الخلية حجم مساحة التخزين المؤقت والقدرات البوتاسيوم 6 و 8. ونقل الغلوتامات astroglial الحالي هو مقياس الحساسة الإفراج الغلوتامات قبل المشبكي، قادرة على رصد التغيرات قصيرة الأجل في احتمال الإصدار 3 و 5 و 9. وعلاوة على ذلك يمكن أن تستخدم لتوصيف وظيفي المشبك الدبقية التفاعلات في نقاط الاشتباك العصبي مختلفة أو في الحادي والتنموية المختلفةالأعمار 10. وينبغي التأكيد على أن درجة الحرارة العالية هي GLTs 11 الحساسة ويقودها التدرج الكهروكيميائية من نا +، + K وH +12. وبالتالي السعة وحركية التيار GLT تعتمد إلى حد كبير على الظروف التجريبية المختارة. وعلاوة على ذلك، ومن المعروف أن دورة الوقت الفعلي لإزالة الغلوتامات astroglial المستمدة من GLT الحالي المسجل إلى أن تحجب جزئيا. هذا ويرجع ذلك إلى تصفية التيارات GLT عن عوامل مثل خصائص سريان التيار الكهربي من الخلايا النجمية أو الإفراج الارسال غير متزامن، التي تشوه حركية بهم 13. وقد تم تطوير أساليب استخراج ميزات الزمني للآليات الترشيح، ويمكن استخدامها لاشتقاق إزالة الغلوتامات الفعلية دوام في حالات فيزيولوجية أو مرضية، كما يؤديها recenly 6،13،14. بالإضافة إلى ذلك، في وقت واحد تسجيل من إزالة الاستقطاب الغشاء astroglial، في المشبك الحالية، يمكن أن توفر insigHTS في التعديلات المحتملة للالعابرين البوتاسيوم خارج الخلية. الخلايا النجمية واحد اتصل تصل إلى 100،000 نقاط الاشتباك العصبي من الخلايا العصبية 100 ~ مختلفة، وبالتالي لا تدمج وتعدل نشاط الشبكات العصبية المحلية.
عند استخدام هذه التقنية المقدمة هنا تسجيل أي الكهربية خلية كاملة من الردود الخلايا النجمية للحصول على أفكار في النشاط متشابك القاعدية، ينبغي للمرء أن نضع في الاعتبار أن الخلايا النجمية في التصحيح، المشبك، تسجيلات على المستوى سوما تسمح التيارات كشف مصدرها في الغالب من خلية سوما أو العمليات القريبة. في الواقع، والتيارات في الكشف عن سوما جزئيا فقط تنشأ من العمليات البعيدة غرامة عندما التنشيط قوية من المستقبلات والقنوات التي تحدث في عمليات متعددة غرامة يمكن أن تولد تيارات نشر إلى سوما الخلية. وبالتالي مستقبلات القاعدية والنشاط في القناة العمليات الفردية الصغيرة التي تغطي حجرات astroglial متشابك قابلا للاكتشاف على الإطلاق. هذا يرجع جزئيا إلى محدودية اليرقاتالاتحاد العالمي للتعليم والزمنية السيطرة على التيارات والفولتية الغشاء بواسطة التسجيلات التصحيح، المشبك خلية كاملة من الخلايا النجمية في الموقع. ومع ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن سطح عمليات فيرة نجمي صغيرة يتجاوز إلى حد بعيد منطقة الغشاء من العمليات الرئيسية وسوما. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه microdomains perisynaptic astroglial تحتوي على مستقبلات ذات الصلة وظيفيا وقنوات، والتي تلعب دورا هاما المحتمل في الاتصالات وتنظيم دبقية متشابك. هذه التقنية قدمنا هنا بالتالي فهي مفيدة في الغالب لدراسة التكامل نجمي النشاط متزامن من الفرق العصبية، والتي تحدث بشكل خاص خلال التحفيز afference. لا ينبغي أن تستخدم لدراسة الحوار بين نقاط الاشتباك العصبي الفردية وعمليات المتاخمة نجمي غرامة تحدث خلال النشاط العفوي القاعدية. وطريقة بديلة لدراسة الردود astroglial المحلية الناجمة عن النشاط متشابك القاعدية تكون لأداء التسجيلات المشبك التصحيح من العمليات الدقيقة، ودواحد من كل التشعبات 15. على الرغم من أن هذه العمليات الترقيع غرامة astroglial تتحدى الأرجح بسبب صغر حجمها، وربما هو وسيلة لتحقيق لكشف الحوار أكثر حميمية بين microdomains astroglial ونقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك، قد الكهربية الصغيرة المرجح الردود astroglial الناتجة عن العمليات الفردية astroglial الغرامة أدناه كشف العتبة، منذ الضوضاء الكهربائية تصل في المتوسط سنويا 3-5 في التصحيح، المشبك التسجيلات. طريقة أخرى لدراسة الردود astroglial إلى النشاط متشابك هو التصوير الكالسيوم، منذ تفعيل مستقبلات غشاء نجمي أو نقل المواد من neuroactive يمكن أن تؤدي العابرين الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، قد تحميل الجزء الأكبر من الخلايا النجمية مع مؤشرات الكالسيوم أيضا تعكس أساسا جسدية النشاط 16. الجمع بين التصوير الكهربية والكالسيوم يمكن أيضا الكشف عن إشارات الكالسيوم الصغيرة من عمليات astroglial غرامة، والتي تحدث إما تلقائيا أو أثار بذ التحفيز متشابك الحد الأدنى 17 و 18. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن مؤشرات الكالسيوم عالية تقارب قد تتصرف مثل مخازن الكالسيوم وتثبيط مسارات الكالسيوم المهم الإشارة، في حين تقارب المؤشرات المنخفضة قد عمل تحت مستوى الكشف. وأخيرا، تقنية أنيقة وغير الغازية لدراسة الأحداث الكالسيوم في عمليات نجمي الدقيقة، والتي تلتف أيضا من بين الخلايا جزيئات تبييض يشير خلال خلية كاملة التصحيح، المشبك، ويتألف جهاز استشعار في استخدام الغشاء الكالسيوم المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا النجمية في الموقع، وكذلك في الجسم الحي 19. ومع ذلك، يمكن التصوير الكالسيوم توفر سوى معلومات حول جزيء إشارة واحدة، التي تشارك في العديد من الأنشطة ولكن ليس كل الخلوية، في حين خلية كاملة التصحيح، المشبك يوفر معلومات كمية عن جميع التيارات الأيونية مختلفة أدت إلى قناة وتفعيل مستقبلات. في وقت واحد ولذلك الكهربية التسجيلات من الخلايا العصبية والخلايا النجميةهي طريقة فريدة وقوية على الانترنت لكشف ديناميات إشارات الأيونية دبقية ومعلوماتها الدماغ تجهيز الدور.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر دانا Kamalidenova، Autexier مورغان، وChopier روش، الذي جعل الفيديو والرسوم المتحركة، وكذلك لبيك فلوريان الصور ومرحلة ما بعد الإنتاج من الفيديو الصوت عبر. وقد رعت هذا العمل من أوليمبوس وبدعم من المنح المقدمة من HFSPO (شهادة جائزة التنمية)، ANR (البرنامج ناطقون chercheurs وبرنامج علوم الأعصاب بلان)، FRC (الاتحاد بور LA RECHERCHE سور جنيه Cerveau)، ولوس انجليس INSERM سالبيتريير Salpêtrière المستشفى (الأبحاث المترجمة العقد) لNR، من وزارة البحوث الفرنسية ودويتشه زمالات ما بعد الدكتوراه لForschungsgemeinschaft UP، ومن "في حدود علوم الحياة" الدكتوراه المدرسة، باريس ديدرو جامعة بيتنكور شولر الأساس، وFRM (مؤسسة بحوث بور لا MEDICALE) زمالة الدكتوراه لJS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
