Summary
Ici, nous développons les outils nécessaires pour
Abstract
Nous avons développé un système qui intègre l'imagerie en direct de marqueurs fluorescents et des tranches de culture du neuro-épithélium embryonnaire de la souris. Nous avons profité de lignées de souris existants pour la cellule génétique lignée de traçage: une ligne Cre inductible par le tamoxifène et une ligne de journaliste exprimant Cre DsRed lors de la recombinaison Cre-médiation. En utilisant un niveau relativement bas du tamoxifène, nous étions capables d'induire la recombinaison dans un petit nombre de cellules, ce qui permet de suivre les divisions cellulaires individuels. En outre, nous avons observé la réponse transcriptionnelle à Sonic Hedgehog (Shh) de signalisation utilisant un Olig2-eGFP transgénique ligne 1-3 et nous avons suivi la formation des cils en infectant la tranche cultivé avec le virus exprimant le marqueur de cils, SSTR3-GFP 4. Afin d'image à l'neuroépithélium, nous avons récolté embryons à E8.5, isolé du tube neural, fixé la tranche de neurones dans des conditions de culture appropriées dans la chambre de formation d'image et réalisée en accéléré imagerie confocale. Notre exvivo méthode imagerie en temps réel permet de tracer des divisions cellulaires simples pour évaluer la chronologie relative de la formation des cils primaires et la réponse Shh d'une manière physiologiquement pertinents. Cette méthode peut être facilement adapté en utilisant des marqueurs fluorescents distinctes et fournit le terrain, les outils permettant de surveiller le comportement des cellules in situ et en temps réel.
Protocol
souris adultes sont euthanasiés par dislocation cervicale mécanique. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le IACUC et le Comité de biosécurité de l'Université Emory.
1. Embryon Generation
- Cross tamoxifène Cre inductible ligne, CAGGCreER, et la ligne de journaliste dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figure 1) 5,6. Pour suivre la chronologie relative de la réponse Shh dans les cellules filles, croix CAGGCreER et DsRed ligne avec le Olig2-eGFP BAC souris transgéniques (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figure 1) 7,8.
- Dissoudre le tamoxifène dans l'éthanol à 100%, et d'effectuer une injection intrapéritonéale de 2,5 mg de tamoxifène par 40 g de poids corporel des femelles gravides à 6,5 embryonnaire (E6.5) pour induire l'expression Cre et l'étiquetage DsRed dans un petit sous-ensemble de cellules.
- 48 heures plus tard disséquer embryons, d'identifier les embryons positifs DsRed utilisant le microscope à fluorescence, les transférer à la boîte de culture et observateurse divisions cellulaires simples lors de l'imagerie ex vivo (voir ci-dessous).
2. Whole embryon de souris Culture
- Disséquer E8.5 embryons en milieu de lavage préchauffé contenant DMEM/F12 (1:1) complété avec 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) 9.
- Directement après dissection, place embryons sur ° étage de chauffage 37 ° C sous le microscope fluorescent et d'identifier que la GFP et / ou DsRed positive (voir ci-dessous).
- Transfert jusqu'à 2 embryons dans une goutte 500 ul de milieux de culture pré-équilibrée contenant 50% sérum de rat d'un mâle Sprague-Dawley et 50% DMEM/F12 (1:1) sans rouge de phénol additionné de L-glutamine et 1% des 1 M HEPES dans NaCl 0,85% et P / S 9.
- Appliquer une couche mince (0,1 cm) d'huile minérale légère équilibrée sur le moyen pour éviter l'évaporation et le transfert de la boîte de culture contenant les embryons à la 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
3.Infection virale
- Afin de cils de l'étiquette dans le neuroépithélium, ajouter 5-10 pi de SSTR3-GFP lentivirus, environ 2 millions de virions, à une baisse de 500 ul équilibrée de milieu de culture contenant un embryon E8.5.
- Après 18 heures de culture, de transférer l'embryon infecté dans quelques gouttes de milieu de lavage pour laver le virus et préparer tranche du tube neural.
4. Neural Tube Slice Préparation pour l'imagerie en direct
- Disséquer tube neural de l'embryon E8.5 en milieu de lavage préchauffé en utilisant une taille de micro-couteau 0.025 mm, sur un 1% d'agar plat enduit.
- Placez le neural face ventrale du tube isolé dans une goutte 150 ul de milieu de culture équilibrée sans rouge de phénol sur le mm enduit plat à fond de verre poly-L-lysine 35.
- Mettez de petites quantités d'un mélange 1:1 en 100% pur de la vaseline et la cire de bougie fondue (bougie d'IKEA) autour du tube neural monté, et appuyez doucement par une étroite bande de lamelle de verre afin d'immobiliser l'échantillon.
- Couvrir le plat avec une couche mince (~ 0,1 cm) d'huile minérale légère équilibrée (Figure 2).
5. Vivre Imaging and Time-lapse microscopie confocale
- Placez le plat sous le Nikon A1R Laser Microscope inversé confocal équipé d'une chambre environnementale qui régule la température, réglé à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Utilisez 60x objectif à immersion d'huile d'enregistrer GFP cils étiquetés et cellules positives DsRed, tandis que l'utilisation de l'objectif à immersion d'huile 40x pour surveiller Olig2-GFP et des cellules positives DsRed.
- Ouvrez le logiciel NIS Elements pour mettre en place les conditions d'imagerie time lapse. Chaque 10 min acquérir z piles allant jusqu'à 25 um avec un espacement de 1,5 um (40x) et jusqu'à 8 pm avec un espacement de 0,4 um (60x objectif). Utilisez 488 et 561 nm les longueurs d'onde d'excitation et le canal transmis si nécessaire. Acquérir des images à 512 x 512 taille. Mettre en place plusieurs régions définies par l'utilisateur de intEREST pour effectuer un enregistrement en même temps.
Exposition optimale à la puissance du laser et de la luminosité de l'image a été ajusté par l'utilisation intensité du laser bas (jusqu'à 11% pour mCherry 561; jusqu'à 4,5% EGFP 405/488), vitesse de balayage 1, ligne moyenne 2 et la taille du trou d'épingle (61 um pour dsRED; 28,1 um pour Olig2; 72 um pour SSTR3GFP; 61,3 um pour dsRED et SSTR3GFP; 58 um pour dsRED et Olig2). L'utilisation de reporters fluorescentes codées génétiquement nous a permis de détecter la luminosité avec une puissance laser de faible. - Analyser les données enregistrées en utilisant un logiciel 3D Imaris de reconstruction.
6. Immunofluorescence
- Fixer des embryons ou des tubes neuraux isolés dans du paraformaldéhyde 4% / 0,1 M de tampon phosphate sur la glace (4 ° C) pendant 1 heure dans un plat en verre.
- Lavez échantillons 2 h dans du PBS sur la glace (4 ° C) (variation PBS quelques fois) et de mettre en saccharose à 30% / 0,1 M de tampon phosphate au cours de la nuit ou jusqu'à ce que les embryons évier.
- Intégrer dans l'OCT, gel sur la glace sèche et le ranger dans -80 ° C. Perform sectionner le cryostat (10 mm).
- Laver les lames pendant 10 min dans une solution de lavage contenant 1% de sérum de mouton inactivés par la chaleur et de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS.
- Diluer anticorps primaires dans la solution de lavage à la suite de concentrations: Rat monoclonal anti-DP (5F8), 1:200; lapin anti-Arl13b 1:1500 sérum et anticorps monoclonal de souris anti-Arl13b 01h05 (295B/54); lapin anti-Olig2 1:300; anticorps monoclonaux de souris Pax6, chut et Nkx2.2-all 01h10 et de lapin polyclonaux Ki67 1:500. Ajouter environ 150 pi par diapo dans chambre humidifiée plat, couvrir avec du parafilm pour éviter le dessèchement et laisser sur la nuit à 4 ° C.
- Laver les lames dans une solution de lavage à trois reprises, à 20 min à chaque fois à la température ambiante.
- Diluer anticorps secondaire Alexa Fluor 488, 568, 350 dans les solutions de lavage à 1:200 concentration. Utilisez Hoechst 1:3,000 ou TO-PRO-3 1:500 pour colorer les noyaux. Ajouter 150 ul par diapositive, laisser 1 heure à température ambiante en chambre humide abri de la lumière.
- Laver les lames dans la solution de lavage two fois, 30 min à chaque fois à la température ambiante.
- Mont glisse dans 80% ProLong réactif et vue anti-fade or dans les 24 heures.
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Representative Results
Ici, nous avons effectué ex vivo l'imagerie en direct de divisions cellulaires simples dans le neuroépithélium souris E8.5. Pour marquer les cellules individuelles, nous avons provoqué la recombinase Cre dans un sous-ensemble de cellules contenant une ligne de journaliste Cre celle exprimée DsRed lors de la recombinaison 5,6 (figure 3A). Ainsi, 48 heures plus tard, nous avons pu observer des divisions cellulaires simples pendant ex imagerie in vivo (figures 4a-d). Parallèlement, nous avons suivi lorsque les cellules marquées sont devenus Shh-sensibles en incluant un journaliste de la transcription Shh BAC transgénique ligne Olig2-EGFP (figures 3C-D, les chiffres 4G-N) a modifié 1-3. Pour observer la formation de cils, nous avons généré SSTR3-GFP lentivirus pour infecter les embryons en culture (figure 3B, les figures 4A-D) 4. Immunofluorescence a été effectuée pour confirmer les résultats in vivo (figures 4E-F).
Le temps-tourse observation confocale d'imagerie des embryons rapporteurs dsRedCre exprimant Olig2-EGFP ou infectés par SSTR3-GFP lentivirus pendant la culture in vitro sont montré à la figure 5 10. Afin d'être sûr que l'expression SSTR3-GFP que nous utilisions pour visualiser cils n'était pas interférer avec un processus biologique sous-jacente, nous avons corroboré nos données d'imagerie en direct avec des sections d'embryons de type sauvage fixes. Parce que nous avons trouvé le même pourcentage d'asynchronisme dans la formation des cils et la réponse Chut, il indique que le virus SSTR3-GFP n'a pas d'incidence sur ces processus (figure 5A).
Figure 1. Organigramme de la procédure d'imagerie en temps réel ex vivo en utilisant neuroépithélium de la souris. L'souris finale croix et tamoxitraitement fen sont représentés suivi par l'ensemble du procédé de culture d'embryons de souris. Embryons exprimant des protéines marquées par fluorescence sont sélectionnés et préparés pour l'imagerie en direct. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Neural préparation de tranches de tube pour l'imagerie en direct. A) E8.5 embryon non retournée avec la première apparition de paires de somites. B) Tube Neural disséqué en milieu pré-chauffé à l'aide d'un micro-couteau. C) tranche du tube neural est monté face ventrale sur le la poly-L-lysine enduit plat à fond de verre. D) faible quantité d'un mélange à base de vaseline et de la cire appliquée autour du tube neural et doucement couvert par un napièce de rrow de verre lamelle. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Visualisation des protéines marquées par fluorescence dans les cellules vivantes du tube neural avec la microscopie confocale. A) étiquettes DsRed cellules individuelles. B) SSTR3-GFP lentivirus exprimé dans les cils primaires comme ils formulaire (flèches jaunes). CD) E8.5 embryon porteur Olig2-GFP montre l'expression de la GFP dans les neuroépithélium. Bar est de 30 um (A, D), de 15 um (B) et 1,5 um (C).
Figure 4. formation de surveillance des cils et signalisation de Shh dans les cellules du tube neural développement de division. J.-C.) seule cellule positif DsRed subir division affiche un cil formes dans une cellule fille avant de l'autre cellule (C, flèche blanche). Le film a été imagée à un rythme d'une trame toutes les 10 min. EF) par immunofluorescence en utilisant des anticorps contre DP en vert (pour DsRed lignée de traçage) et Arl13b en rouge (pour les cils). L'élargissement de la zone boîte (E), sans Hoechst (F). GN) La cellule positif DsRed subit division (IM). Le Olig2-GFP est exprimée dans une seule fille (J, N). L'enregistrement a été imagé à un débit d'une trame toutes les 10 min. Bar est à 5 um (AD), 50 um (F), 25 um (GN).
Figure 5. Le comptage des cellules positives DsRed de cils et l'apparence Shh. A) Nombre de cellules DsRed subissant division et la localisation des cils. Symbole * entend par formation de cils d'imagerie en temps réel était synchrone. B) Nombre de DsRed et cellules positives Olig2-GFP en cours de division et de signalisation de Shh.
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Discussion
Notre système ex vivo nous permet d'observer directement divisions cellulaires uniques dans le neuroépithélium développement en temps réel. À titre d'exemple, nous avons examiné les divisions cellulaires dans le tube neural embryonnaire de la souris et surveillés soit la formation cil ou réponse Shh. Nous avons confirmé nos résultats d'imagerie (n = 24) ont été cohérents avec les résultats des sections fixes (n = 178) indiquant notre technique fournit des données physiologiquement pertinents.
Notre technique repose sur Cre induction étant limité à un sous-ensemble de cellules de sorte que la dose de tamoxifène doit être précise. Nous avons travaillé sur le dosage pour l'étiquetage des cellules individuelles. Nous croyons qu'il serait facile d'étiqueter les petits clones de cellules avec une légère augmentation de la dose en fonction de l'analyse initiale de la ligne CAGGcreER, qui a montré une réponse dose-dépendante au tamoxifène 6. En outre, les conditions de culture d'embryons sont essentiels, comme le développement anormal se produit si les conditions sont éteintes.Nous avons confirmé que le développement se déroule normalement dans les conditions de culture que nous avons utilisés, qui sont connus pour fonctionner pendant au moins 36 h 11.
Les Cre inductible et Cre lignes de journaliste que nous utilisons sont accessibles au public peuvent donc être facilement obtenus rendant cette technique tout à fait adaptables aux chercheurs avec une variété de questions. La vraie puissance de notre technique est que dans l'étiquetage génétiquement des cellules individuelles, notre approche peut être utilisée pour interroger le comportement de cellules individuelles dans les nombreuses lignées de souris mutantes actuels et futurs. Ce sera essentiel pour comprendre ce qui se passe vraiment mal dans beaucoup de ces lignes que l'observation directe des cellules dans l'embryon des mammifères pendant le développement n'a pas été examinée en profondeur. Notre incorporaton de journalistes fluorescentes codées génétiquement pour détecter la luminosité avec une puissance laser de faible donne un réel avantage pour une telle observation. Il est facile d'imaginer les protéines marquées par fluorescence marquage organites cellulaires spécifiques ou d'autres trjournalistes anscriptional être intégrées dans le futur.
Nous nous sommes intéressés à la chronologie relative de la formation de cil primaire et la réponse Shh dans les cellules filles d'une division cellulaire. Cependant, la lignée transgénique qui nous a permis de contrôler la réponse Shh exprimé Olig2-EGFP dans le cytoplasme, nous empêchant de voir le marqueur du cil primaire, SSTR3-GFP dans la même cellule. Ainsi, nous aurions grandement bénéficié soit d'une restriction Olig2-eGFP nucléaire ou un SSTR3 fusion de la protéine fluorescente spectralement distinctes.
En plus d'utiliser la ligne ciblée et transgénique, nous avons montré que notre technique peut être adaptée en utilisant des vecteurs viraux et qui infecte le neuroépithélium dans la culture fournit des données utiles. Cela sera utile aux enquêteurs en fournissant une méthode plus rapide que la génération d'une lignée de souris génétiquement modifiées. En outre, l'approche peut valider la génération d'une telle ligne, en effet, nos données soutiennent une transligne génique exprimant SSTR3-GFP sera d'une grande utilité sur le terrain.
Notre méthode fournit des outils avec lesquels le champ peut plus immédiatement surveiller le comportement des cellules. Couplé aux riches ressources de mutants de souris que nous attendons que cette méthode soit particulièrement puissante dans l'examen d'une série de comportements cellulaires in situ.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce projet de recherche a été soutenue par un supplément ARRA, 5 R01 NS056380. Un soutien supplémentaire a été fourni par le vecteur viral de base et le noyau de microscopie de l'Emory Neuroscience NINDS les principales installations de subvention, P30NS055077. Nous remercions la souris transgénique Emory et Gene Targeting base pour dériver la lignée de souris à partir de GENSAT; Greg Pazour pour la lignée cellulaire SSTR3-GFP IMCD3 stable et Bradley Yoder pour le SSTR3-GFP lentiviral construisons. Les anticorps monoclonaux ont été obtenus à partir des études du développement Hybridoma Bank, élaboré sous les auspices du NICHD, et entretenus par l'Université de l'Iowa, Département des sciences biologiques, Iowa City, IA 52242. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le IACUC et le Comité de biosécurité de l'Université Emory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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