Aquí desarrollamos las herramientas necesarias para<em> Ex vivo</em> Imágenes en vivo de rastrear las divisiones de células individuales en el ratón E8.5 neuroepitelio
Hemos desarrollado un sistema que integra imágenes en vivo de los marcadores fluorescentes y las rebanadas de cultivo embrionario neuroepitelio del ratón. Nos aprovechamos de las actuales líneas de ratones de células linaje genético rastreo: una línea Cre tamoxifeno-inducible y una línea reportero Cre expresan dsRed por recombinación Cre-mediada. Mediante el uso de un nivel relativamente bajo de tamoxifeno, hemos sido capaces de inducir la recombinación en un pequeño número de células, lo que permite que sigamos divisiones celulares individuales. Además, se observó la respuesta transcripcional de la proteína Sonic Hedgehog (Shh) de señalización utilizando un Olig2-EGFP transgénicos línea 1-3 y que supervisó la formación de los cilios mediante la infección de la porción cultivada con virus que expresa el marcador de los cilios, SSTR3-GFP 4. Con el fin de imagen del neuroepitelio, que cosecharon embriones a E8.5, aislado del tubo neural, montado la rebanada neuronal en condiciones de cultivo adecuadas en la cámara de formación de imágenes y realiza de lapso de tiempo de imagen confocal. Nuestro exvivo método de imagen en directo nos permite trazar divisiones celulares individuales para evaluar el tiempo relativo de formación de los cilios primarios y la respuesta de Shh en forma fisiológicamente relevante. Este método se puede adaptar fácilmente el uso de marcadores fluorescentes distintos y proporciona el campo de las herramientas con las que monitorean el comportamiento de células in situ y en tiempo real.
Nuestro sistema ex vivo nos permite observar directamente las divisiones de células individuales dentro del neuroepitelio en desarrollo en tiempo real. A modo de ejemplo se analizaron las divisiones celulares en el tubo neural embrionario del ratón y monitoreamos ni formación cilio o respuesta Shh. Confirmamos nuestras imágenes de los resultados (n = 24) fueron consistentes con los resultados de las secciones fijas (n = 178) que indican nuestra técnica proporciona datos fisiológicamente …
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto de investigación fue apoyada por un suplemento de ARRA, 5 R01 NS056380. Se prestó apoyo adicional a través de la Core Vector viral y el Core Microscopía de la Emory Neurociencia NINDS Core Instalaciones subvención, P30NS055077. Damos las gracias al ratón transgénico Emory y Gene Targeting Core para derivar la línea de ratones de GENSAT; Greg Pazour para la línea celular SSTR3-GFP IMCD3 estable, y Bradley Yoder para la SSTR3-GFP lentiviral construir. Los anticuerpos monoclonales se obtuvieron de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA 52242. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC y el Comité de Seguridad de la Biotecnología en la Universidad de Emory.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffer | Lab made | ||
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
Hoechst | Fisher | AC22989 | |
TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |