Summary
Qui sviluppiamo gli strumenti necessari per
Abstract
Abbiamo sviluppato un sistema che integra l'imaging dal vivo di marcatori fluorescenti e fette di coltura embrionale neuroepithelium mouse. Abbiamo approfittato di linee del mouse esistenti per la cellula genetica lineage tracing: una linea di Cre tamoxifene-inducibile e una linea giornalista Cre esprimendo DsRed su ricombinazione Cre-mediata. Utilizzando un livello relativamente basso di tamoxifene, siamo stati in grado di indurre ricombinazione in un piccolo numero di cellule, permettendo di seguire divisioni cellulari individuali. Inoltre, abbiamo osservato la risposta trascrizionale di Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione utilizzando un Olig2-eGFP transgenico linea 1-3 e abbiamo monitorato formazione di ciglia infettando la fetta colta con virus che esprime il marcatore di ciglia, SSTR3-GFP 4. Per l'immagine del neuroepitelio, abbiamo raccolto gli embrioni a E8.5, isolato il tubo neurale, montata la fetta neurale in appropriate condizioni di coltura nella camera di imaging e di eseguita time-lapse imaging confocale. Il nostro exmetodo di imaging in vivo in diretta consente di tracciare divisioni cellulari singoli di valutare la relativa tempistica di formazione ciglia primarie e risposta Shh in modo fisiologicamente rilevanti. Questo metodo può essere facilmente adattato utilizzando marcatori fluorescenti distinti e fornisce il campo gli strumenti con cui monitorare il comportamento delle cellule in situ ed in tempo reale.
Protocol
Topi adulti sono sacrificati per dislocazione cervicale meccanico. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.
1. Generazione Embryo
- Croce tamoxifene-inducibile Cre linea, CAGGCreER, e la linea giornalista dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Per monitorare la relativa tempistica di risposta Shh nelle cellule figlie, croce CAGGCreER e DsRed linea con il Olig2-eGFP BAC topi transgenici (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) 7,8.
- Sciogliere tamoxifene in 100% di etanolo, ed eseguire l'iniezione intraperitoneale di 2,5 mg di tamoxifene per 40 g di peso corporeo nelle femmine gravide a 6,5 embrionale (E6.5) per indurre l'espressione Cre ed etichettatura DsRed in un piccolo sottogruppo di cellule.
- 48 ore più tardi sezionare embrioni, identificare gli embrioni positivi DsRed utilizzando il microscopio a fluorescenza, trasferirli al piatto cultura e osservatoriposta divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (vedi sotto).
2. Tutta mouse Embrione Cultura
- Sezionare embrioni E8.5 nel medio lavaggio preriscaldata contenente DMEM/F12 (1:1) supplementato con 10% di siero di vitello neonato e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) 9.
- Direttamente dopo la dissezione, posto embrioni sulla ° C fase di riscaldamento 37 al microscopio a fluorescenza e di identificare come GFP e / o DsRed positivo (vedi sotto).
- Trasferire fino a 2 embrioni in 500 microlitri goccia di terreni di coltura pre-equilibrata contenente 50% siero di ratto da un maschio Sprague-Dawley e il 50% DMEM/F12 (1:1) senza rosso fenolo integrato con L-glutammina e 1% di 1 M HEPES in NaCl 0,85% e P / S 9.
- Applicare uno strato sottile (0.1 cm) di olio minerale leggero equilibrata nel medio per evitare l'evaporazione e trasferire il piatto di coltura contenente gli embrioni ai 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
3.Infezione virale
- Al fine di etichetta cilia nel neuroepitelio, aggiungere 5-10 ml di SSTR3-GFP lentivirus, circa 2 milioni di virioni, ad un 500 microlitri goccia equilibrata di terreno di coltura contenente un embrione E8.5.
- Dopo 18 ore di coltura, il trasferimento di embrioni infetti in diverse gocce di mezzo di lavaggio per lavare il virus e preparare fetta del tubo neurale.
4. Del tubo neurale Slice Preparazione per Live Imaging
- Sezionare tubo neurale del E8.5 embrione in media lavaggio pre-riscaldato utilizzando un formato micro-coltello 0,025 millimetri, su un piatto rivestito di agar 1%.
- Posizionare il tubo laterale isolato neurale ventrale giù in una goccia 150 ml di terreno di coltura equilibrato senza rosso fenolo sulla mm rivestito di vetro piatto fondo di poli-L-lisina 35.
- Mettere una piccola quantità di una miscela 1:1 realizzato da gelatina pura al 100% di petrolio e cera fusa (candela da IKEA) attorno al tubo neurale montato, e premere delicatamente da una stretta lingua di coprioggetto di vetro, al fine diimmobilizzare il campione.
- Coprire il piatto con un sottile strato (~ 0,1 centimetri) di olio minerale leggero equilibrata (Figura 2).
5. Vivere Imaging e Time-lapse Microscopia confocale
- Luogo piatto sotto la Nikon A1R confocale microscopio invertito dotato di una camera climatica che regola la temperatura, impostata a 37 ° C, e il 5% di CO 2.
- Utilizzare 60x obiettivo ad immersione in olio a registrare GFP ciglia etichettati e cellule positive DsRed, mentre l'uso obiettivo ad immersione in olio 40x per monitorare Olig2-GFP e cellule positive DsRed.
- Aprire il software NIS Elements per creare le condizioni di imaging lasso di tempo. Ogni 10 min acquisire z-stack fino a 25 micron con una spaziatura di 1,5 micron (obiettivo 40x) e fino a 8 micron con una spaziatura di 0,4 micron (60x obiettivo). Usare 488 e 561 nm, la lunghezza d'onda di eccitazione e di canali trasmessi, se necessario. Acquisire immagini in formato 512 x 512. Impostare più regioni definite dall'utente di interest per eseguire la registrazione simultanea.
Ottima esposizione al potere del laser e la luminosità dell'immagine è stata regolata mediante l'uso del laser a bassa intensità (fino al 11% per mCherry 561 e fino al 4,5% EGFP 405/488), velocità di scansione 1, media linea 2 e la dimensione del foro del perno (61 micron per DsRed; 28,1 micron per Olig2; 72 micron per SSTR3GFP; 61,3 micron per DsRed e SSTR3GFP; 58 micron per DsRed e Olig2). L'uso di giornalisti fluorescenti geneticamente codificati ci ha permesso di rilevare la luminosità con basso potere del laser. - Analizzare i dati registrati utilizzando Imaris software di ricostruzione 3D.
6. Immunofluorescenza
- Fissare gli embrioni o tubi neurali isolate in paraformaldeide al 4% / 0,1 M tampone fosfato sul ghiaccio (4 ° C) per 1 ora in un piatto di vetro.
- Lavare i campioni 2 ore in PBS su ghiaccio (4 ° C) (cambiamento PBS un paio di volte) e mettere nel 30% di saccarosio / 0,1 M tampone fosfato durante la notte o fino a quando gli embrioni lavandino.
- Incorpora in ottobre, congelare in ghiaccio secco e conservare in -80 ° C. Peffettuare la giusta sezionamento sul criostato (10 mm).
- Lavare i vetrini per 10 min in soluzione di lavaggio contenente siero ovino inattivato al calore 1% e 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Diluire gli anticorpi primari in soluzione di lavaggio a seguito di concentrazioni: Rat monoclonale anti-RFP (5F8,) 1:200; coniglio anti-ARL13B siero 1:1500 e topo monoclonale anti-ARL13B 01:05 (295B/54); coniglio anti-Olig2 1:300; monoclonali mouse Pax6, Shh e Nkx2.2-all 1:10; ed policlonale di coniglio Ki67 1:500. Aggiungere circa 150 ml per diapositiva nel piatto camera umidificata, coprire con parafilm per evitare la disidratazione e lasciare tutta la notte a 4 ° C.
- Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio per tre volte, ogni volta 20 min a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi secondari Alexa Fluor 488, 568, 350 nelle soluzioni di lavaggio a 1:200 concentrazione. Utilizzare Hoechst 1:3000 o TO-PRO-3 1:500 a macchia nuclei. Aggiungere 150 microlitri per vetrino, lasciare 1 ora a temperatura ambiente in camera umidificata al riparo dalla luce.
- Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio two volte, ogni volta 30 min a temperatura ambiente.
- Monte scivola nel 80% Prolungare Oro reagente anti-sbiadimento e la vista entro 24 ore.
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Representative Results
Qui abbiamo effettuato ex vivo imaging dal vivo di divisioni cellulari singoli all'interno del E8.5 del mouse neuroepitelio. Per etichettare singole celle, abbiamo indotto ricombinasi Cre in un sottogruppo di cellule contenenti una linea giornalista Cre che esprimevano DsRed upon ricombinazione 5,6 (Figura 3A). Così, 48 ore dopo siamo stati in grado di osservare le divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (Figure 4A-D). Allo stesso tempo, abbiamo monitorato quando le cellule etichettate divennero Shh-reattiva, includendo un giornalista trascrizionale Shh modificato BAC transgenico linea Olig2-eGFP (Figure 3C-D; Figures 4G-N) 1-3. Per osservare la formazione delle ciglia abbiamo generato SSTR3-GFP lentivirus di infettare gli embrioni in coltura (Figura 3B; Figure 4A-D) 4. L'immunofluorescenza è stata effettuata per confermare in vivo (figure 4E-F).
Il time-lapse l'imaging confocale osservazione degli embrioni giornalista dsRedCre esprimono Olig2-eGFP o infettati con SSTR3-GFP lentivirus durante la coltura in vitro sono rappresentati nella Figura 5 10. Per essere sicuri che l'espressione SSTR3-GFP che usavamo per visualizzare le ciglia non interferiva con qualsiasi processo biologico sottostante, abbiamo corroborato i nostri dati di immagini dal vivo con sezioni di embrioni wild-type fissi. Perché abbiamo trovato la stessa percentuale di asincronia nella formazione delle ciglia e la risposta Shh, indica il virus SSTR3-GFP non ha impatto di questi processi (Figura 5A).
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di imaging dal vivo ex vivo utilizzando neuroepithelium mouse. Il mouse croce finale e tamoxitrattamento fen sono raffigurati seguita da tutta la cultura metodo di embrione di topo. Gli embrioni che esprimono proteine fluorescenti con tag vengono selezionati e preparati per l'imaging dal vivo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Del tubo neurale preparazione fetta per l'imaging dal vivo. A) E8.5 embrione intentato con prima comparsa di coppie somite. B) del tubo neurale sezionato in media pre-riscaldato utilizzando un micro-coltello. C) fetta del tubo neurale è montato lato ventrale verso il basso sul poli-L-lisina rivestito di vetro piatto inferiore. D) Piccola quantità di una miscela a base di vaselina e cera applicata attorno al tubo neurale e delicatamente coperto da un narrow pezzo di vetro coprioggetto. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Visualizzazione fluorescente proteine marcate in cellule vive del tubo neurale con microscopia confocale. A) etichette DsRed singole cellule. B) SSTR3-GFP lentivirus espresso in ciglia primarie come forma (frecce gialle). CD) E8.5 embrione portando Olig2-GFP mostra espressione GFP all'interno neuroepitelio. Bar è 30 um (A, D), 15 micron (B) e 1,5 micron (C).
Figura 4. Monitoraggio della formazione ciglia e segnalazione Shh nelle cellule in divisione del tubo neurale in via di sviluppo. DC) Singolo DsRed cella positiva in fase di divisione mostra si forma un ciglio in una cellula figlia prima che l'altra cella (C, freccia bianca). Il film è stato ripreso ad una velocità di un fotogramma ogni 10 min. EF) immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro RFP in verde (per DsRed lineage tracing) e ARL13B in rosso (per le ciglia). Allargamento della zona in scatola (E), senza che la Hoechst (F). GN) La cella positiva DsRed subisce divisione (IM). Il Olig2-GFP è espresso soltanto in una figlia (J, N). La registrazione è stato ripreso in ragione di un frame ogni 10 min. Bar è di 5 micron (AD), 50 micron (F), 25 micron (GN).
Figura 5. Conteggio dei DsRed cella positiva con ciglia e l'aspetto Shh. A) numero di cellule in fase di divisione DsRed e localizzazione ciglia. Simbolo * significa per la formazione delle ciglia imaging dal vivo era sincrono. B) Numero di DsRed e Olig2 GFP-positive cellule che subiscono la divisione e la segnalazione Shh.
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Discussion
Il nostro sistema ex vivo permette di osservare direttamente divisioni cellulari singoli all'interno del neuroepitelio in tempo reale via di sviluppo. Come esempio abbiamo esaminato divisioni cellulari entro il mouse embrionale tubo neurale e vigilato o formazione ciglio o risposta Shh. Abbiamo confermato i nostri risultati di imaging (n = 24) erano coerenti con i risultati di sezioni fisse (n = 178) che indicano la nostra tecnica fornisce dati fisiologicamente rilevanti.
Nostra tecnica si basa sulla Cre induzione essendo limitata a un sottogruppo di cellule così la dose di tamoxifene deve essere preciso. Abbiamo lavorato fuori il dosaggio per l'etichettatura di singole cellule. Noi crediamo che sarebbe facile etichettare piccoli cloni di cellule con un leggero aumento della dose sulla base dell'analisi iniziale della linea CAGGcreER, che ha mostrato una risposta dose-dipendente al tamoxifene 6. Inoltre, le condizioni di coltura degli embrioni sono critiche, come sviluppo anormale si verifica se le condizioni sono spenti.Abbiamo confermato che lo sviluppo procede normalmente alle condizioni di coltura che abbiamo usato, che sono noti a lavorare per almeno 36 ore 11.
Inducibile Cre e Cre linee giornalista che utilizziamo sono pubblicamente disponibili in modo possono essere facilmente ottenuti rendendo questa tecnica abbastanza adattabile a ricercatori con una serie di domande. Il vero potere della nostra tecnica è che in singole cellule geneticamente etichettatura, il nostro approccio può essere utilizzato per interrogare il comportamento di singole cellule nei topi mutanti molte linee esistenti e futuri. Questo sarà fondamentale per capire cosa sta veramente andando male in molte di queste linee come l'osservazione diretta di cellule all'interno dell'embrione di mammifero durante lo sviluppo non è stato ampiamente esaminato. Il nostro incorporaton di reporter fluorescenti geneticamente codificati per rilevare la luminosità con basso potere laser fornisce un reale vantaggio per tale osservazione. E 'facile immaginare proteine fluorescenti tag di marcatura specifici organelli cellulari o altri trgiornalisti anscriptional essere integrati in futuro.
Ci interessava la relativa tempistica di formazione ciglio primario e la risposta Shh nelle cellule figlie di una cellula che si divide. Tuttavia, la linea transgenica che ci ha permesso di monitorare la risposta Shh espresso Olig2-eGFP in tutto il citoplasma, ci precludendo di vedere il marcatore del ciglio primario, SSTR3-GFP nella stessa cella. Così, avremmo grandemente beneficiato sia da un ristretto Olig2-eGFP nucleare o un spettralmente distinta SSTR3 fluorescente proteina di fusione.
Oltre a utilizzare la linea mirata e transgenici, abbiamo dimostrato che la nostra tecnica può essere adattata utilizzando costrutti virali e che infettare il neuroepitelio nella cultura fornisce dati utili. Questo sarà utile per investigatori nel fornire un metodo più veloce di generazione di una linea di topi geneticamente modificati. Inoltre, l'approccio può convalidare la generazione di una tale linea, anzi, i nostri dati sostengono un translinea genica esprimendo SSTR3-GFP sarà di grande utilità per il campo.
Il nostro metodo fornisce strumenti con cui il campo può controllare più direttamente il comportamento delle cellule. Accoppiato alle ricche risorse di mutanti del mouse ci aspettiamo che questo metodo sia particolarmente potente in esame di una serie di comportamenti cellulari in situ.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da un supplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Ulteriore supporto è stato fornito tramite il vettore virale Core e Core Microscopia della Emory Neuroscienze NINDS Nucleo Facilities Grant, P30NS055077. Ringraziamo il mouse Emory transgenico e Gene Targeting Nucleo per derivare la linea di mouse da GENSAT; Greg Pazour per il SSTR3-GFP linea cellulare IMCD3 stabile e Bradley Yoder per il SSTR3-GFP lentivirali costruiamo. Gli anticorpi monoclonali sono stati ottenuti da studi di sviluppo Hybridoma Banca, sviluppato sotto l'egida del NICHD, e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 52242. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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