Her kan vi utvikle de nødvendige verktøy for<em> Ex vivo</em> Sanntidsavbildning å spore enkelt celledelinger i musen E8.5 neuroepithelium
Vi har utviklet et system som integrerer direkte avbildning av fluorescerende markører og dyrking skiver av embryonale mus neuroepithelium. Vi tok nytte av eksisterende mus linjer for genetisk celle avstamning tracing: en tamoxifen-induserbar Cre linje og en Cre reporter linjen uttrykker DsRed på Cre-mediert rekombinasjon. Ved å bruke et relativt lavt nivå av tamoxifen, var vi i stand til å indusere rekombinasjon i et lite antall celler, tillater oss å følge de enkelte celledelinger. I tillegg observerte vi transcriptional svar på Sonic Hedgehog (Hysj) signal ved hjelp av en Olig2-eGFP transgene linjen 1-3 og vi overvåkes dannelsen av flimmerhårene ved å infisere den kultiverte skive med virus som uttrykker flimmerhårene markør, Sstr3-GFP fire. For å avbilde neuroepithelium, vi høstet embryoer på E8.5, isolert nevralrøret, montert det nevrale skive i riktig dyrking forhold til bildebehandling kammeret og utførte time-lapse confocal bildebehandling. Vår exvivo direkte avbildning metoden gjør oss i stand til å spore enkelt celledelinger for å vurdere den relative timing av primære cilier dannelse og Hysj respons i en fysiologisk relevant måte. Denne metoden kan enkelt tilpasses ved hjelp av ulike fluorescerende markører og gir feltet de verktøyene som brukes til å overvåke celle atferd in situ og i sanntid.
Vår ex vivo-systemet gjør oss i stand til å direkte observere encellete divisjoner innenfor utvikling neuroepithelium i sanntid. Som et eksempel undersøkte vi celledelinger i løpet av musen embryonale nevralrøret og overvåkes enten cilium formasjon eller Hysj respons. Vi bekreftet våre bildebehandling resultater (n = 24) var i samsvar med resultatene fra faste seksjoner (n = 178) som indikerer vår teknikk gir fysiologisk relevante data.
Vår teknikk er avh…
The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsprosjektet ble støttet av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ekstra støtte ble gitt gjennom Viral Vector Core og den Mikroskopi Kjernen i Emory Neuroscience ninds Kjerne utstyr stipend, P30NS055077. Vi takker Emory transgene mus og Gene Targeting Kjerne for å utlede musen linje fra GENSAT; Greg Pazour for stallen SSTR3-GFP IMCD3 cellelinje, og Bradley Yoder for Sstr3-GFP lentiviral konstruere. Monoklonale antistoffer ble innhentet fra Developmental Studies hybridom Bank, utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdes av The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, 52242 IA. Alle dyr prosedyrene ble godkjent av IACUC og biosikkerhet Committee ved Emory University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffer | Lab made | ||
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
Hoechst | Fisher | AC22989 | |
TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |