Burada için gerekli araçları geliştirmek<em> Ex vivo</em> Canlı görüntüleme fare E8.5 neuroepithelium tek hücre bölünmeleri izlemek için
Biz floresan işaretleri ve embriyonik fare neuroepithelium kültür dilim canlı görüntüleme entegre bir sistem geliştirdi. Biz izleme soy genetik hücre için mevcut fare hatları yararlandı: Bir Tamoksifen-indüklenebilir Cre hattı ve Cre-aracılı rekombinasyon üzerine dsRed ifade eden bir Cre muhabir hattı. Tamoksifen nispeten düşük düzeyde kullanarak, bize tek tek hücre bölünmeleri takip etmek izin, hücrelerin az sayıda rekombinasyon neden başardık. Ayrıca, bir Olig2-eGFP transgenik çizgi 1-3 kullanarak Sonic Hedgehog (Sus) sinyal için transkripsiyonel yanıt gözlenen ve kirpikler işaretleyici, Sstr3-GFP 4 ifade virüs kültürlü dilim nüfuz ederek kirpikler oluşumu izlenir. Görüntü için neuroepithelium, biz nöral tüp izole, E8.5 embriyolar hasat, görüntüleme odasına uygun kültür koşullarında sinir dilim monte ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yapılır. Bizim eskiin vivo canlı görüntüleme yöntemi bize fizyolojik ilgili bir şekilde birincil kirpikler oluşumu ve Sus cevap göreli zamanlama değerlendirmek için tek bir hücre bölünmeleri izlemek için sağlar. Bu yöntem, kolayca farklı floresan işaretleri kullanarak adapte ve alanında yerinde ve gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını izlemek için hangi ile araçları sağlar olabilir.
Bizim ex vivo sistem bize doğrudan gerçek zamanlı olarak gelişmekte neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek sağlar. Örnek olarak fare embriyonik nöral tüp içinde hücre bölünmeleri incelenmiş ve kirpik oluşumu veya Sus yanıt ya izlenir. Biz teknik fizyolojik ilgili verileri sağlar gösteren sabit bölümleri (n = 178) sonuçları ile uyumlu idi bizim görüntüleme sonuçları (n = 24) doğruladı.
Bizim teknik tamoksifen do…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma projesi bir ARRA Ek, 5 R01 NS056380 tarafından desteklenmiştir. Ek destek Viral vektör Core ve Emory Nörobilim NINDS Çekirdek Hizmetleri hibe, P30NS055077 en Mikroskopi Çekirdek ile sağlanmıştır. Istikrarlı SSTR3-GFP IMCD3 hücre hattı için Greg Pazour,, Biz GENSAT gelen fare hattı türetmek için Emory Transgenik Fare ve Gen Hedefleme Çekirdek teşekkür ve Sstr3-GFP lentiviral için Bradley Yoder inşa. Monoklonal antikorlar NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından muhafaza edildi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffer | Lab made | ||
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
Hoechst | Fisher | AC22989 | |
TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |