Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

Summary

Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

Abstract

O modelo tradicional tumor subcutâneo é menos do que ideal para estudar o câncer colorretal. Modelos de ratos ortotópico de câncer colorretal, que apresentam células cancerosas em crescimento em sua localização natural, replicar a doença humana com alta fidelidade. Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer este modelo. Ambas as técnicas são semelhantes, e requer anestesia mouse e laparotomia para exposição do ceco. Uma técnica envolve a injeção de uma suspensão de células do câncer colorretal na parede cecal. As células cancerosas são primeiramente cultivadas na cultura, colhidas quando confluentes e preparado como uma suspensão única célula. Um volume pequeno de células é injetado lentamente para evitar fugas. A outra técnica envolve o transplante de uma peça de tumor subcutâneo para o ceco. Um rato com um tumor colorretal previamente estabelecidos subcutânea é eutanásia eo tumor é removido utilizando técnica estéril. A peça de tumor é dividido em pequenos pedaços para transplante para outro mouse. Antes do transplante, a parede cecal é levemente danificada para facilitar a infiltração de células tumorais. O tempo para o desenvolvimento de tumores primários e metástases hepáticas irá variar dependendo da técnica, linha celular, e as espécies de mouse usado. Este modelo do rato ortotópico é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

Protocol

I. Preparação celular

1. Células de câncer colorretal são cultivadas em cultura e colhidos quando confluentes.
2. A suspensão única célula é preparada em tampão fosfato salina e mantidos em gelo.

II. Preparação do tumor

1. Um rato com um tumor colorretal previamente estabelecidos subcutânea é eutanasiado.
2. O tumor subcutâneo é removido usando técnica estéril e dividido em pedaços 2-3 milímetros
3. As peças tumor são mantidos em tampão fosfato salino no gelo.

III. Preparação do mouse

Nota: Em nosso laboratório usamos isoflurano inalado para anestesiar o rato, alternativamente, pode-se usar anestésicos injetáveis ​​para alcançar o mesmo efeito

1. A profundidade da anestesia é avaliada através de pinch dedo do pé. Não deve haver reflexo retirar com pitada dedo do pé.
2. Antibióticos pode ser dada neste momento.
3. O rato anestesiado, que anteriormente era raspada, está posicionada corretamente.
4. O abdômen é preparado com uma solução de betadine.
5. Do abdômen e do sítio cirúrgico é coberto de forma estéril.

IV. Laparotomia

1. Um nick pequeno é feito na pele
2. A musculatura da parede abdominal é agarrado e levantado
3. A cavidade abdominal é inserido e uma única lâmina da tesoura é usada para empurrar o conteúdo intra-abdominal de distância
4. A incisão é estendida a 2-3 cm

V. exposição do ceco

1. O ceco com sua bolsa terminando cego é identificado e exteriorizado
2. O ceco é isolado do resto do mouse usando um pré-corte de gaze estéril,
3. Salina morna é usada para manter a umidade do ceco

VI. Injeção de células para a parede do ceco

1. A G 27 ou mais fina agulha é usada para injetar um volume de 50 mL de células na parede cecal
2. A agulha é removida
3. O local da injeção é inspecionado para garantir que não haja vazamento
4. O ceco é retornado para a cavidade abdominal

VII. Transplante de Tumor sobre o Ceco

Nota: Além de injetar células na parede cecal, uma abordagem alternativa é o transplante tumor para o ceco

1. Uma figura de oito ponto é colocado no ceco com 6-0 ou 7-0 sutura tamanho
2. A parede cecal é levemente danificados
3. Então, o pedaço do tumor é posicionado
4. O ponto é amarrado
5. O ceco é retornado para a cavidade abdominal

VIII. Rato fechamento da parede abdominal e recuperação

1. A parede abdominal do rato é fechado com três pontos interrompidos com 3-0 ou 4-0 sutura tamanho
2. Alternativamente, pode-se usar um ponto simples execução
3. Pós-operatório de analgésicos e um bolus de fluido pode ser dada neste momento
4. O mouse é permitida a recuperação anestésica.

Nota: Com anestésicos inalatórios isso normalmente leva 30 segundos

IX. Resultados - tumor primário e metástase hepática

Tumor primário - mostrado in situ (A) e com evidência de neovascularização (B); na coloração H & E, os tumores são localmente invasivos (C)

As metástases no fígado - mostrado ex vivo (D)

Discussion

Embora os modelos de tumor subcutâneo do rato são fáceis de estabelecer e monitorar, é claro que este modelo não pode replicar o site original anatômica do câncer colorretal. Devido à diferença de microambiente, células de câncer colorretal crescer sob a pele têm sido mostrados para mudar seu fenótipo e quase sempre falham ao progresso e metástases ^1,2. Na verdade, a resposta do tumor à terapia pode variar drasticamente, dependendo se as células cancerosas são implantados em uma gravidez ectópica (subcutânea) versus localização ortotópico ^3. Modelos de ratos ortotópico de câncer colorretal, que apresentam células cancerosas em crescimento em sua localização natural, replicar a doença humana com alta fidelidade. As duas técnicas para estabelecer este modelo tem vantagens e desvantagens. Injeção de uma suspensão de células na parede cecal introduz as células do câncer colo-retal que tenham sido previamente crescendo em um ambiente em vitro e são, indiscutivelmente, homogênea. As células podem ter reduzido potencial invasivo ou metastático, após várias passagens em cultura. Transplante de uma peça de tumor subcutâneo apresenta uma população mais heterogênea de células de câncer que foram estabelecidos in vivo. No entanto, tumores contêm células do estroma e freqüentemente têm porções necróticas que podem afetar a consistência desse modelo (comunicação pessoal, I. Fidler, MD Anderson). Do ponto de vista técnico, nosso laboratório descobriu que a injeção de uma suspensão de células na parede cecal é mais difícil e carrega o risco de injeção intraluminal e vazamento após a injecção. Curiosamente, um modelo de camundongo ortotópico de câncer retal tem sido descrito que não exige do mouse laparotomia ^4. Os ratos são anestesiados e da mucosa retal é prolapso com pressão digital. Um volume pequeno de células de câncer colorretal em suspensão única célula é injetado submucosally. Primário, cânceres invasivos rectal desenvolvem em ratos logo uma semana após a injeção, no entanto, nenhum dos camundongos desenvolvem metástases no fígado e os autores não comentar sobre a freqüência de metasases pulmão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line used
Phosphate Buffered Saline	BioWhittaker	17-512F	also sold by a number of other vendors
15 mL centrifuge tubes, polypropylene	Corning	430790
6 well plates with lid	BD Biosciences	353046
Iris forceps, straight, serrated tips	World Precision Instruments, Inc.	15914	best to have a pair of these instruments
Iris dissecting scissors, straight, sharp	World Precision Instruments, Inc.	14393
Needle Holder (regular)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Needle Holder (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex
6-0 or 7-0 suture			for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF
3-0 or 4-0 suture			for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Anesthetic machine / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	also sold by a number of other vendors
Heating Pad, disposable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Tape, orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	for restraining anesthetized mouse
Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	for shaving mouse fur
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	may also be purchased at any medical supply store
2 x 2 gauze, 3-ply	Johnson & Johnson	7635	may also be purchased at any medical supply store
Sterile Field, Barrier, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	may also be purchased at any medical supply store
Cotton tipped applicators, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	may also be purchased at any medical supply store
Syringe, 10 cc, Luer lock tip	BD Biosciences	309604
Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip	BD Biosciences	309602
27 1/2 G needle	BD Biosciences	305109
30 G needle	BD Biosciences	305106