Summary
이게 맹장에 피하 종양의 조각의 cecal 벽이나 이식으로 암 세포 현탁액의 주입 : 두 기술이 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.
Abstract
전통 피하 종양 모델은 대장암을 연구에 이상적보다 적습니다. 그들의 자연적인 위치에 성장하는 암 세포를 특징 대장암의 Orthotopic 마우스 모델, 높은 성실과 인간의 질병을 복제합니다. 두 기술은이 모델을 수립하는 데 사용할 수 있습니다. 두 기술과 유사하며 맹장의 노출에 대한 마우스 마취와 개복술을 필요로합니다. 한 기술은 cecal 벽에 대장암의 세포 현탁액의 주입을 포함한다. 암 세포 먼저, 문화, 재배 때 subconfluent 수확 및 단일 세포 현탁액으로 준비하고 있습니다. 세포의 작은 볼륨 누출을 피하기 위해 천천히 주입합니다. 다른 기술은 맹장에 피하 종양의 조각의 이식을 포함한다. 이전에 설립 피하 대장암 종양을 가진 마우스는 euthanized되고 종양은 멸균 기술을 사용하여 제거됩니다. 종양이 작품은 다른 마우스에 이식을위한 작은 조각으로 나뉘어져 있습니다. 이전 이식하는 cecal 벽은 가볍게 종양 세포 침투를 용이하게하기 위해 손상되었습니다. 차 종양과 간 metastases을 개발하는 시간은 기술, 세포주, 및 사용 마우스 종류에 따라 달라집니다. 이 orthotopic 마우스 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.
Protocol
I. 셀 준비
- 대장암 세포는 문화에 재배 언제 subconfluent 수확한 수 있습니다.
- 단일 세포 현탁액은 인산에 준비하는 것은 생리 버퍼와 얼음에 보관.
II. 종양 준비
- 이전에 설립 피하 대장암 종양을 가진 마우스는 euthanized이다.
- 피하 종양은 2-3밀리미터 조각으로 살균 기술을 사용하여 제거하고 나누어져 있습니다
- 종양이 조각은 인산에 보관하는 것은 얼음 호수 버퍼.
III. 마우스 준비
참고 : 저희 연구실에서는 마우스를 마취하는 isoflurane 흡입 사용; 또는 하나는 동일한 효과를 달성하기위한 주사용 anesthetics을 사용할 수 있습니다
- 마취의 깊이는 발가락 핀치를 사용하여 평가됩니다. 발가락 핀치와 반사 철회도 없을 것입니다.
- 항생제는이 시점에서 주어진 수 있습니다.
- 이전 면도되었다 anesthetized 마우스는, 적절하게 배치됩니다.
- 복부는 betadine 솔루션을 준비하고 있습니다.
- 복부와 외과 사이트는 살균 방식에 draped 있습니다.
IV. 개복술
- 작은 닉은 피부에 이루어집니다
- 복부 벽 근육이 파악하고 부축입니다
- 복강은 입력과 가위의 단일 블레이드가 떨어져 내부 복부 내용을 추진하는 데 사용됩니다
- 절개는 2~3cm로 확장
이게 맹장의 V. 노출
- 그 맹인 끝나는 파우치로이게 맹장은 식별 및 exteriorized입니다
- 이게 맹장은 미리 절단, 멸균 거즈를 사용하여 마우스의 나머지 부분으로부터 격리
- 따뜻한 생리는 맹장의 촉촉한을 유지하는 데 사용됩니다
VI. Cecal 장벽에 셀의 분사
- 27 G 또는 미세한 바늘이 cecal 벽에 전지의 50 μL 볼륨을 삽입하는 데 사용됩니다
- 주사 바늘을 제거
- 사출 사이트가 더 유출을 보장하지 검사입니다
- 이게 맹장은 복강에 반환됩니다
VII. 이게 맹장에 종양의 이식
참고 : cecal 벽에에 세포를 주입하는 것 외에도 대안 접근 방식은이게 맹장에 종양을 이식하는 것입니다
- 8 스티치의 수치는 6-0 또는 7-0 크기의 봉합사를 사용하여 맹장에 배치됩니다
- cecal 벽면은 살짝 손상
- 그런 다음, 종양이 작품은 위치이다
- 스티치가 아래로 묶여있다
- 이게 맹장은 복강에 반환됩니다
VIII. 마우스 복벽 폐쇄 및 복구
- 마우스 복벽는 3-0 또는 4-0 크기 봉합사로 3 중단 바늘을 사용하여 폐쇄
- 또는, 하나는 간단한 실행 바늘을 사용할 수 있습니다
- 포스트 수술 진통제와 액체 볼러스이 시점에서 주어진 수
- 마우스가 마취에서 회복하기 위해 허용됩니다.
참고 : 흡입 anesthetics로이 일반적으로 30 초 소요
IX. 검색 결과 - 기본 종양 및 간 전이
기본 종양 - 현장에 표시 (A)와 neovascularization의 증거 (B)로, H & E 염색법에 종양 로컬 침략 아르 (C)
간 Metastases - 표시 예 생체내 (D)
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Discussion
마우스 피하 종양 모델 확립 및 모니터링 쉬운 있지만,이 모델은 대장암의 원래 해부 사이트를 복제할 수 없다는 분명하다. microenvironment의 차이로 인해, 피부 아래에 성장 대장암 세포들은 표현형을 변경하고 거의 항상 1,2를 진보와 전이에 실패 표시되었습니다. 사실, 치료 종양 반응은 암세포가 이소성 (피하) 대 orthotopic 위치 3의 이식 여부에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그들의 자연적인 위치에 성장하는 암 세포를 특징 대장암의 Orthotopic 마우스 모델, 높은 성실과 인간의 질병을 복제합니다. 이 모델을 확립하기 위해 두 기술은 고유의 장점과 단점이 있습니다. cecal 벽에 세포 현탁액의 주사 이전 체외 환경에서 성장했습니다 대장암 세포를 소개하고 틀림없이 균질하고 있습니다. 세포는 문화의 여러 구절 후 침입 또는 전이성 잠재력을 감소 할 수 있습니다. 피하 종양의 한 부분의 이식은 생체내에 설립되어 암 세포보다 이기종 인구를 소개합니다. 그러나, 종양 stromal 세포를 포함하고 자주이 모델 (개인 통신, I. 피들러, MD 앤더슨)의 일관성에 영향을 미칠 수있는 괴사 부분이 있습니다. 기술적인 관점에서, 우리 연구실은 cecal 벽에 세포 현탁액의 주입 더 어렵게하고 intraluminal 주입 및 누출 후 주사의 위험을 실시 것을 발견했습니다. 흥미롭게도, 직장 암의 orthotopic 마우스 모델은 마우스 개복술 4 필요없는 것을 설명했습니다. 마우스가 anesthetized하고 직장의 점막은 디지털 압력 prolapsed 있습니다. 단일 세포 현탁액에서 대장암 세포의 작은 볼륨 submucosally 주입니다. 주, 침입 직장 암은 주사 후 일주 빠르면 생쥐의 개발, 그러나 생쥐의 아무도 간 metastases을 개발하지 않고 저자는 폐 metasases의 주파수에 대해서는 언급하지 않았다.
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Acknowledgments
외과 계열, 캘리포니아 대학, 샌프란 시스코
레이몬드 샤힌, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
