Summary
Çekum üzerine bir kanser hücre süspansiyonu çekal duvar subkutan tümörün bir parçasının veya transplantasyon içine enjeksiyon: İki teknikleri bu modeli kurmak için kullanılan olabilir. Bu model, kolorektal kanseri doğal bir ilerleme eğitim ve kolorektal kansere karşı yeni tedavi ajanları test için yararlıdır.
Abstract
Geleneksel subkutan bir tümör modeli kolorektal kanser eğitimi için ideal daha az. Kolorektal kanser özelliği, doğal bir yerde çoğalan kanser hücrelerini, Ortotopik fare modelleri, yüksek sadakat, insan hastalık yineler. Bu modeli kurmak için iki teknik kullanılabilir. Her iki teknikte de benzer ve çekum maruz kalma fare anestezi ve laparotomi gerektirir. Bir teknik çekal duvar içine kolorektal kanser hücre süspansiyonu enjeksiyon içerir. Kanser hücreleri kültürde yetişen zaman akışkan hasat ve tek bir hücre süspansiyonu olarak hazırlanmıştır. Hücrelerin küçük bir ses sızıntısını önlemek için yavaş yavaş enjekte edilir. Diğer teknik çekum üzerine subkutan bir tümör bir parça nakli içerir. Önceden belirlenmiş subkutan kolorektal tümör ile bir fare ötenazi ve steril tekniği kullanarak tümör kaldırılır. Tümör parçasının başka bir fare nakli için küçük parçalara ayrılır. Nakli için, önce çekal duvara hafifçe tümör hücre infiltrasyonu kolaylaştırmak için zarar görmüştür. Birincil tümörleri ve karaciğer metastazlarının geliştirmek için zaman, tekniği, hücre hattı ve kullanılan fare türlerinin bağlı olarak değişecektir. Bu ortotopik fare modelinde, kolorektal kanseri doğal bir ilerleme eğitim ve kolorektal kansere karşı yeni tedavi ajanları test için yararlıdır.
Protocol
I. Hücre Hazırlık
- Kolorektal kanser hücrelerinin kültür ortamında yetişen ve akışkan hasat.
- Bir tek hücre süspansiyonu fosfat hazırlanan tamponlu tuz ve buz üzerinde tutulmalıdır.
II. Tümör Hazırlık
- Önceden belirlenmiş subkutan kolorektal tümör ile bir fare ötenazi.
- Subkutan bir tümör 2-3 mm'lik parçalar steril tekniği kullanarak kaldırıldı ve bölünmüş
- Tümör adet fosfat tutulur buz üzerinde tamponlu salin.
III. Fare Hazırlık
Not: Laboratuarımızda fare uyutmak için izofluran inhale kullanır; alternatif olarak, aynı etkiyi elde etmek için enjektabl anestezikler kullanabilirsiniz
- Anestezi derinliği ayak tutam kullanılarak değerlendirilir. Ayak tutam refleks çekilme yoktur olmalıdır.
- Antibiyotikler bu noktada verilebilir.
- Daha önce traş anestezi fare, düzgün bir şekilde konumlandırılmış.
- Karın betadin çözümü ile prepped.
- Karın ve cerrahi alan steril bir moda dökümlü.
IV. Laparotomi
- Küçük bir nick cilt yapılır
- Karın duvarı kas kavradı ve kaldırdı
- Karın boşluğuna girilir ve makas, tek bir bıçak uzak intraabdominal içeriğini itmek için kullanılır.
- Kesi 2-3 cm uzatıldı
Çekum V. Pozlama
- Kör biten çantası ile birlikte çekum tespit ve exteriorized
- Çekum önceden kesilmiş, steril gazlı bez kullanarak fare geri kalanından izole
- Ilık tuzlu su çekum nemli tutmak için kullanılır.
VI. Hücreler Çekal Duvar içine enjeksiyon
- A 27 G veya ince iğne çekal duvarın içine 50 mcL hacmi bir hücre enjekte etmek için kullanılır.
- Iğne kaldırıldı.
- Enjeksiyon yerinde, herhangi bir kaçak olmak üzere kontrol
- Çekum karın boşluğuna geri döndü
VII. Çekum üzerine Tümör Nakli
Not: çekal duvar içine hücreleri enjekte ek olarak, alternatif bir yaklaşım çekum üzerine tümör nakli için
- 8 dikiş bir rakam, 6-0 veya 7-0 ölçekli sütür kullanarak çekum üzerine yerleştirilir.
- Çekal duvara hafifçe hasar görmüş
- Ardından, tümörün parça konumlandırılmış
- Dikiş bağlı
- Çekum karın boşluğuna geri döndü
VIII. Fare Karın Duvarı Kapatma ve Kurtarma
- Fare karın duvarı, 3-0 veya 4-0 ölçekli sütür kullanarak üç kesintiye dikiş kullanılarak kapalı
- Alternatif olarak, bir çalışan basit bir dikiş kullanabilirsiniz
- Post-operatif ağrı kesiciler ve bu noktada bir sıvı bolus verilebilir
- Fare anestezi kurtarmak için izin verilir.
Not: inhale anestezikler bu genellikle 30 saniye sürer
IX. Sonuçlar - İlköğretim Tümör ve Karaciğer Metastaz
Primer Tümör - yerinde gösterilir (A) ve (B) neovaskülarizasyon kanıt, H & E boyama, tümörler, lokal olarak invaziv (C)
Karaciğer Metastaz gösterilen ex vivo (D)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare subkutan bir tümör modelleri oluşturmak ve izlemek için kolay olmasına rağmen, bu model, kolorektal kanser orijinal anatomik site çoğaltmak olamayacağını açıktır. Mikroçevresinin farkı nedeniyle, deri altında büyüyen kolorektal kanser hücrelerinin fenotipi değiştirmek ve hemen hemen her zaman ilerleme ve metastaz 1,2 başarısız gösterilmiştir. Aslında, tedaviye tümör yanıtı, kanser hücrelerinin ektopik (subkutan) karşı ortotopik konumu 3 implante olup olmadığına bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Kolorektal kanser özelliği, doğal bir yerde çoğalan kanser hücrelerini, Ortotopik fare modelleri, yüksek sadakat, insan hastalık yineler. Bu modeli kurmak için iki teknik kendine özgü avantaj ve dezavantajları var. Çekal duvar içine bir hücre süspansiyonu enjeksiyon daha önce in vitro ortamda büyüyen kolorektal kanser hücrelerinin tanıtır ve tartışmalı homojendir. Hücreler çeşitli kültür pasajlar sonra invaziv veya metastatik potansiyeli azalır olabilir. Subkutan bir tümör bir parça Nakli, in vivo olarak kurulmuş olan kanser hücreleri daha heterojen nüfus tanıtır. Ancak, tümörler stromal hücreleri içeren ve sık sık bu model (kişisel iletişim, I. Fidler, MD Anderson) tutarlılığı etkileyebilecek nekrotik kısımları var. Teknik açıdan bakıldığında, laboratuvarımızda hücre süspansiyonu çekal duvar içine enjeksiyon daha zordur ve intraluminal enjeksiyon ve kaçak enjeksiyon sonrası riskler taşıdığını tespit etmiştir. İlginçtir ki, rektal kanser ortotopik fare modelinde fare laparotomi 4 gerektirmez tarif edilmiştir. Fareler anestezi ve rektal mukoza dijital basınç prolabe. Kolorektal kanser hücreleri tek bir hücre süspansiyonu bir küçük hacimli submukozal enjekte edilir. İlköğretim enjeksiyondan sonra bir hafta gibi erken olarak, invaziv rektum kanserleri farelerde gelişir, ancak hiçbiri farelerin karaciğer metastazlarının geliştirmek ve yazarlar akciğer metasases sıklığı üzerine yorum yapmadı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Cerrahi Anabilim Dalı, University of California, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
