Summary
Zwei Techniken können verwendet werden, um dieses Modell zu etablieren werden: Injektion einer Krebszelle Suspension in den Blinddarm Wand oder Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor auf den Blinddarm. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung der natürlichen Entwicklung von Darmkrebs und Erprobung neuer Therapeutika gegen den Darmkrebs.
Abstract
Die traditionellen subkutanen Tumor-Modell ist weniger als ideal für das Studium des kolorektalen Karzinoms. Orthotopen Mausmodell des kolorektalen Karzinoms, die Krebszellen wachsen in ihrem natürlichen Standort-Funktion, replizieren menschlichen Krankheiten mit hoher Wiedergabetreue. Zwei Techniken können verwendet werden, um dieses Modell zu etablieren. Beide Techniken sind ähnlich und erfordern Maus Anästhesie und Laparotomie für die Exposition des Blinddarms. Eine besteht darin, Injektion eines kolorektalen Karzinoms Zellsuspension in den Blinddarm Wand. Krebszellen werden zuerst in Kultur angebaut, geerntet, wenn subkonfluenten und hergestellt, wie eine einzelne Zelle Suspension. Ein kleines Volumen der Zellen wird langsam, um ein Auslaufen zu vermeiden injiziert. Die andere Technik beinhaltet die Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor auf den Blinddarm. Eine Maus mit einem vorher festgelegten subkutane kolorektalen Tumor eingeschläfert und der Tumor wird entfernt, indem sterile Technik. Der Tumor Stück ist in kleine Stücke für die Transplantation zu einem anderen Maus unterteilt. Vor der Transplantation wird der Blinddarm Wand leicht beschädigt, um Tumor-Zell-Infiltration zu erleichtern. Die Zeit bis zur Entwicklung von Primärtumoren und Lebermetastasen hängt von der Technik-, Zell-Linie, und die Maus Arten verwendet. Diese orthotopen Mausmodell ist nützlich für die Untersuchung der natürlichen Entwicklung von Darmkrebs und Erprobung neuer Therapeutika gegen den Darmkrebs.
Protocol
I. Cell Preparation
- Darmkrebs-Zellen in Kultur gezüchtet und geerntet werden, wenn subkonfluenten.
- Eine einzelne Zelle Suspension wird in Phosphat-gepufferter Saline und auf Eis gehalten.
II. Tumor Vorbereitung
- Eine Maus mit einem vorher festgelegten subkutane kolorektalen Tumor eingeschläfert.
- Die subkutane Tumor wird entfernt, indem sterile Technik und in 2-3 mm Stücke geteilt
- Der Tumor Stücke sind in Phosphat gehalten Kochsalzlösung auf Eis.
III. Maus Vorbereitung
Hinweis: In unserem Labor verwenden wir eingeatmet Isofluran, um die Maus zu betäuben, alternativ kann man Injektionsnarkosemittel verwenden, um denselben Effekt zu erzielen
- Die Narkosetiefe wird anhand Zehen klemmen. Es sollte keine zurückzutreten Reflex mit Zehen klemmen.
- Antibiotika können an dieser Stelle gegeben werden.
- Die narkotisierten Maus, die vorher rasiert wurde, richtig positioniert ist.
- Der Bauch ist mit einem betadine Lösung vorbereitet.
- Die Bauch-und OP-Gebiet sind in einer sterilen Mode drapiert.
IV. Laparotomie
- Eine kleine Nick ist in die Haut gemacht
- Die Bauchwandmuskulatur begriffen und hob
- Die Bauchhöhle wird eingegeben und ein einziges Blatt der Schere wird verwendet, um die intra-abdominale Inhalte wegschieben
- Der Schnitt wird um 2-3 cm verlängert
V. Exposure des Blinddarms
- Der Blinddarm mit seinen blind endende Tasche identifiziert und exteriorisierten
- Der Blinddarm ist vom Rest der Maus über einen pre-cut, sterile Gaze isoliert
- Warm Kochsalzlösung wird verwendet, um den Blinddarm feucht zu halten
VI. Injektion von Zellen in den Blinddarm Wand
- A 27 G oder feiner Nadel wird benutzt, um eine 50 ul Volumen von Zellen in den Blinddarm Wand spritzen
- Die Nadel wird entfernt
- Die Einstichstelle wird überprüft, um sicherzustellen, keine Leckage
- Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück
VII. Die Transplantation von Tumor auf den Blinddarm
Hinweis: Zusätzlich zu injizieren Zellen in den Blinddarm Wand, ist ein alternativer Ansatz zur Tumor auf den Blinddarm Transplantation
- Eine Figur von 8 Stich ist auf den Blinddarm mit 6-0 oder 7-0 große Naht gelegt
- Der Blinddarm Wand ist leicht beschädigt
- Dann wird der Tumor Stück positioniert
- Der Stich ist festgebunden
- Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück
VIII. Maus Bauchwand Closure and Recovery
- Die Maus Bauchdecke geschlossen ist mit drei Stichen unterbrochen mit 3-0 oder 4-0 große Naht
- Alternativ kann man mit einem einfachen Laufstich
- Postoperative Schmerzmittel und ein Flüssigkeitsbolus kann an dieser Stelle gegeben werden
- Die Maus ist erlaubt, aus der Narkose zu erholen.
Hinweis: Bei Inhalationsanästhetika dies in der Regel dauert 30 Sekunden
IX. Ergebnisse - Primärtumor und Lebermetastasen
Primary Tumor - in situ gezeigt (A) und mit dem Nachweis der Gefäßneubildung (B), auf H & E-Färbung, sind Tumoren lokal invasive (C)
Lebermetastasen - gezeigt, ex vivo (D)
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Discussion
Obwohl Maus subkutanen Tumor-Modellen leicht festzustellen und zu überwachen sind, ist es klar, dass dieses Modell nicht replizieren kann die ursprüngliche anatomische Stelle von Darmkrebs. Aufgrund der Differenz in Mikroumgebung haben kolorektalen Krebszellen wachsen unter der Haut gezeigt, ihren Phänotyp zu ändern und fast immer keine Fortschritte und metastasieren 1,2. In der Tat können Ansprechen des Tumors auf die Therapie erheblich variieren je nachdem, ob Krebszellen in einer Eileiterschwangerschaft (subkutan) versus orthotopen Lage 3 implantiert. Orthotopen Mausmodell des kolorektalen Karzinoms, die Krebszellen wachsen in ihrem natürlichen Standort-Funktion, replizieren menschlichen Krankheiten mit hoher Wiedergabetreue. Die beiden Techniken, um dieses Modell zu etablieren haben einzigartige Vorteile und Nachteile. Injektion einer Zellsuspension in den Blinddarm Wand führt Darmkrebs-Zellen, die vorher immer in einer in vitro Umgebung und sind wohl homogen. Zellen können invasive oder metastatische Potential nach mehreren Passagen in Kultur reduziert haben. Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor stellt eine heterogene Population von Krebszellen, die in vivo etabliert haben. Allerdings enthalten Tumoren Stromazellen und häufig nekrotische Anteile, die die Konsistenz dieses Modells (persönliche Mitteilung, I. Fidler, MD Anderson) beeinflussen können. Aus technischer Sicht hat sich unser Labor gefunden, dass die Injektion einer Zellsuspension in den Blinddarm Wand schwieriger ist und trägt die Risiken der intraluminalen Einspritz-und Auslaufen nach der Injektion. Interessanterweise hat einem orthotopen Mausmodell des Rektumkarzinoms wurde beschrieben, dass es nicht erforderlich Maus Laparotomie 4. Mäuse sind betäubt und die rektale Schleimhaut mit digitalen Druck vorgefallen. Ein kleines Volumen von Darmkrebs-Zellen in einzelnen Zellsuspension submukös injiziert. Primär entwickeln invasive Mastdarmkrebs bei Mäusen so früh wie 1 Woche nach der Injektion, aber entwickeln keine der Mäuse Lebermetastasen und die Autoren nicht auf die Häufigkeit von Lungenkrebs metasases Kommentar.
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Acknowledgments
Department of Surgery, University of California, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
