Summary
盲腸に皮下腫瘍の一部の盲腸壁や移植に癌の細胞懸濁液の注入：2つのテクニックは、このモデルを確立するために使用することができます。このモデルでは、大腸癌の自然な進行を勉強し、大腸癌に対する新しい治療薬をテストするのに便利です。
Abstract
従来の皮下腫瘍モデルでは、大腸癌を研究するための理想的とは言えません。彼らの自然な場所で成長してがん細胞を特徴と大腸癌の同所性マウスモデルは、、高忠実度で人間の病気を複製する。 2つの手法は、このモデルを確立するために使用することができます。両方の手法は類似しており、盲腸の露出のためのマウスの麻酔や開腹を必要とする。一つの技術は盲腸壁に大腸癌の細胞懸濁液の注入を含む。がん細胞が最初に、培養で増殖するときにサブコン収穫し、単一の細胞懸濁液として調製されています。細胞の小音量は漏れを避けるためにゆっくりと注入されます。他のテクニックは、盲腸に皮下腫瘍の一部の移植を含む。以前に確立された皮下大腸の腫瘍を持つマウスを安楽死され、腫瘍は無菌操作を用いて除去される。腫瘍部分は、別のマウスへの移植のための小さな断片に分割されています。移植前に、盲腸壁は軽く腫瘍細胞の浸潤を促進するために破損している。原発腫瘍と肝転移を開発する時間はテクニック、細胞株、および使用されるマウスの種によって異なります。この同所マウスモデルでは、大腸癌の自然な進行を勉強し、大腸癌に対する新しい治療薬をテストするのに便利です。
Protocol
I.細胞の調製
- 大腸がん細胞を培養中で成長し、時サブコン収穫されています。
- 単一の細胞懸濁液をリン酸で調製される緩衝生理食塩水と氷上で保存。
II。腫瘍の準備
- 以前に確立された皮下大腸の腫瘍を持つマウスを安楽死されている。
- 皮下腫瘍は無菌操作を用いて除去し、2〜3mmの部分に分かれています。
- 腫瘍部分は氷の上にリン酸緩衝生理食塩水に保存されています。
III。マウスの準備
注：私たちのラボでは、マウスを麻酔イソフルラン吸入使用し、別の方法として、同じ効果を達成するために注射麻酔薬を使用することができます
- 麻酔の深さはつま先のピンチを利用して評価されます。つま先のピンチと反射撤退はないはずです。
- 抗生物質はこの時点で与えることができる。
- 以前に剃毛された麻酔マウスは、、適切に配置されている。
- 腹部はbetadine液で整形処理されています。
- 腹部と手術部位を無菌的に覆われている。
IV。開腹術
- 小さなニックネームは、皮膚で作られています
- 腹壁の筋肉組織が把握して持ち上げられる
- 腹腔が入力され、はさみの単一のブレードは、離れて、腹腔内のコンテンツをプッシュするために使用され
- 切開は2〜3 cmに拡張されています
盲腸のV.露出
- その盲目のエンディングのポーチと盲腸を同定し、体外され
- 盲腸は、プレカット、滅菌ガーゼを使用してマウスの残りの部分から絶縁されています
- 温かい生理食塩水は、盲腸の潤いを保つために使用されます。
VI。盲腸壁への細胞の注入
- 27 Gまたは細かい針は、盲腸壁に細胞の50μLボリュームをインジェクトするために使用されます
- 針は削除されます
- 注射部位は、漏れのないことを確認するために検査され
- 盲腸を腹腔内に返されます。
VII。盲腸上腫瘍の移植
注：盲腸壁に細胞を注入することに加えて、別のアプローチは、盲腸に腫瘍を移植することです。
- 8ステッチの数字は6から0または7から0サイズの縫合糸を使用して盲腸に配置されます
- 盲腸壁は軽く損傷している
- その後、腫瘍の一部が配置されている
- ステッチは縛られている
- 盲腸を腹腔内に返されます。
VIII。マウス腹壁閉鎖と回復
- マウス腹壁は、次の3つの3-0で使用して、中断されたステッチや4から0サイズの縫合糸を使用してクローズされ
- 別の方法として、単純なランニングステッチを使用することができます
- 術後鎮痛薬と流体のボーラスは、この時点で与えることができる
- マウスは、麻酔から回復するために許可されます。
注：吸入麻酔薬で、これは一般的に30秒かかる
IX。結果 - 原発巣と肝転移
原発腫瘍は - その場で示すように（）と血管新生の証拠（B）と、H＆E染色で、腫瘍は局所浸潤性があります（C）
肝転移 - 示されてex vivoで（D）
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Discussion
マウス皮下腫瘍モデルを確立し、監視も簡単ですが、それはこのモデルは、大腸癌の元解剖学的部位を複製できないことは明らかである。微小環境の違いにより、皮膚の下に成長している大腸癌細胞は、それらの表現型を変更し、ほとんどの場合1,2の進行と転移に失敗することが示されている。実際には、治療に対する腫瘍の反応は、がん細胞が異所性（皮下）対同所場所3に注入されているかどうかに応じて劇的に異なることがあります。彼らの自然な場所で成長してがん細胞を特徴と大腸癌の同所性マウスモデルは、、高忠実度で人間の病気を複製する。このモデルを確立する2つの手法は、ユニークな長所と短所があります。盲腸壁に細胞懸濁液の注入は、以前にin vitroでの環境中で成長している大腸癌細胞を導入し、おそらく均一である。細胞は培養中のいくつかの継代後の侵襲または転移の可能性を縮小した可能性があります。皮下腫瘍の部分の移植は、生体内で確立されている癌細胞の多くの異種集団を紹介します。しかし、腫瘍は間質細胞が含まれており、頻繁にこのモデル（個人的なコミュニケーション、I.フィドラー、MDアンダーソン）の一貫性に影響を与える可能性壊死部分を持っている。技術的な観点から、私たちの研究室では、盲腸壁に細胞懸濁液の注入がより困難であると腔内注入及び漏洩注入後のリスクを運ぶことを発見した。興味深いことに、直腸癌の同所性マウスモデルは、マウス開腹術4を必要としないことが記載されている。マウスは麻酔し、直腸の粘膜は、デジタル圧力で脱出されています。単一の細胞懸濁液における大腸癌細胞の小さなボリュームが粘膜下に注入されます。一次、浸潤直腸癌は注射後一週間は早くもマウスで発症しますが、マウスのいずれも肝転移を開発していないし、著者らは、肺のmetasasesの頻度についてはコメントしなかった。
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Acknowledgments
外科、カリフォルニア大学、サンフランシスコ
レイモンドシャヒーン、MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
