Summary
Två tekniker kan användas för att fastställa denna modell: injektion av en cancercell suspensionen i cecal vägg eller transplantation av en bit av subkutan tumör på blindtarmen. Denna modell är användbar för att studera det naturliga förloppet av kolorektal cancer och testa nya behandlingsmetoder mot kolorektal cancer.
Abstract
Den traditionella subkutana tumören modellen är mindre än idealisk för att studera kolorektal cancer. Orthotopic musmodeller av kolorektal cancer, som har cancerceller växer i sin naturliga plats, replikera mänskliga sjukdomar med hög trohet. Två tekniker kan användas för att fastställa denna modell. Båda teknikerna är snarlika och kräver mus anestesi och laparotomi för exponering av blindtarmen. En teknik innebär injektion av en kolorektal cancer cellsuspensionen i cecal väggen. Cancerceller är först odlas i kultur, skördas när subconfluent och förbereds som en enda cell suspension. En liten mängd celler injiceras långsamt för att undvika läckage. Den andra tekniken innebär transplantation av en bit av subkutan tumör på blindtarmen. En mus med en tidigare fastställda subkutan kolorektal tumör är euthanized och tumören avlägsnas med steril teknik. Tumören Stycket är indelat i små bitar för transplantation till en annan mus. Före transplantation är cecal väggen lätt skadade att underlätta tumörceller infiltration. Tiden för att utveckla primära tumörer och metastaser i levern kommer att variera beroende på tekniken, cellinje, och musen används arter. Denna orthotopic musmodell är användbar för att studera det naturliga förloppet av kolorektal cancer och testa nya behandlingsmetoder mot kolorektal cancer.
Protocol
I. cellberedningen
- Kolorektal cancer celler odlas i kultur och skördas när subconfluent.
- En enda cellsuspensionen är upprättad i fosfatbuffrad saltlösning och höll på is.
II. Tumör Förberedelser
- En mus med en tidigare fastställda subkutan kolorektal tumör avlivas.
- Den subkutana tumören avlägsnas med hjälp av steril teknik och delas in i 2-3 mm bitar
- Tumören bitar hålls i fosfatbuffrad saltlösning på is.
III. Mus Förberedelser
Obs: I vårt laboratorium använder vi inandas isofluran att söva musen, alternativt kan man använda Injektionsanestetika för att uppnå samma effekt
- Djupet av anestesi bedöms med hjälp av tå nypa. Det bör inte dra tillbaka reflex med tå nypa.
- Antibiotika kan ges på denna punkt.
- Den sövda mus, som tidigare var rakad, är rätt placerade.
- Buken är förberedd med en Betadine lösning.
- Buken och operationsområdet är draperad i ett sterilt sätt.
IV. Laparotomi
- En liten nick görs i huden
- Bukväggen muskulatur är förstått och lyfts upp
- Bukhålan är in och ett enda blad av saxar används för att driva intraabdominell innehållet bort
- Snittet har utvidgats till 2-3 cm
V. Exponering av blindtarmen
- Blindtarmen med sin blinda slut påse identifieras och exteriorized
- Blindtarmen är isolerad från resten av musen med hjälp av en pre-cut, steril gasbinda
- Varm saltlösning används för att hålla blindtarmen fuktiga
VI. Injektion av celler i cecal Wall
- En 27 G eller finare nål används för att injicera en 50 mikroliter volym av celler i cecal väggen
- Nålen tas bort
- Injektionsstället är inspekteras för att säkerställa att inget läckage
- Blindtarmen är tillbaka till bukhålan
VII. Transplantation av tumör på blindtarmen
Obs: Förutom att injicera cellerna i cecal väggen, är ett alternativ till transplantation tumör på blindtarmen
- En siffra på 8 stygn placeras på blindtarmen med 6-0 eller 7-0 stora sutur
- Den cecal väggen är lätt skadad
- Då är tumören bit placeras
- Stygnen är bunden
- Blindtarmen är tillbaka till bukhålan
VIII. Mus bukväggen Avslutning och återställning
- Musen bukväggen stängs med tre avbrott stygn med 3-0 eller 4-0 stora sutur
- Alternativt kan man använda en enkel rakstygn
- Postoperativa smärtstillande medel och en bolus vätska kan ges på denna punkt
- Musen är tillåtet att återhämta sig från anestesi.
Obs: Med inhalationsanestetika Detta tar vanligtvis 30 sekunder
IX. Resultat - primärtumör och levermetastaser
Primärtumör - visas på plats (A) och med tecken på kärlnybildning (B), om H & E färgning, tumörer är lokalt invasiv (C)
Levermetastaser - visat ex vivo (D)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om musen subkutan tumörmodeller är lätta att fastställa och övervaka, är det tydligt att denna modell inte kan replikera den ursprungliga anatomiska platsen för kolorektal cancer. På grund av skillnaden i mikromiljö, har kolorektal cancer celler som växer under huden visat att förändra sin fenotyp och nästan alltid misslyckas med att framsteg och metastasera 1,2. I själva verket kan tumören svarar på behandlingen varierar kraftigt beroende på om cancerceller implanteras i ett utomkvedshavandeskap (subkutant) jämfört orthotopic plats 3. Orthotopic musmodeller av kolorektal cancer, som har cancerceller växer i sin naturliga plats, replikera mänskliga sjukdomar med hög trohet. De två tekniker för att skapa denna modell har unika fördelar och nackdelar. Injektion av en cell suspensionen i cecal väggen introducerar kolorektal cancer celler som tidigare har ökat i en in vitro-miljö och är utan tvekan homogena. Celler kan ha minskat invasiva eller metastaserande potential efter flera passager i kulturen. Transplantation av en bit av subkutan tumör introducerar en mer heterogen population av cancerceller som har fastställts in vivo. Men tumörer innehåller stromaceller och ofta har nekrotisk delar som kan påverka enhetligheten i denna modell (personlig kommunikation, I. Fidler, MD Anderson). Ur teknisk synvinkel, har vårt laboratorium visade att injektion av en cell suspensionen i cecal väggen är svårare och bär risken för intraluminal injektion och läckage efter injektion. Intressant nog har en orthotopic musmodell av ändtarmscancer har beskrivits som inte kräver mus laparotomi 4. Möss är bedövad och rektala slemhinnan är framfall med digital tryck. En liten volym av kolorektal cancer celler i samma cellsuspension injiceras submucosally. Primära, invasiva rektal cancer utvecklas hos möss så tidigt som en vecka efter injektion, men ingen av möss utvecklar levermetastaser och författarna kommenterade inte frekvensen av lungcancer metasases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Kirurgiska kliniken, University of California, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
