Fiberoptisk Implantasjon for kronisk Optogenetic Stimulering av hjernevev
Summary
Utviklingen av optogenetics gir nå midler til nettopp stimulere genetisk definerte nevroner og kretser, både<em> In vitro</em> Og<em> In vivo</em>. Her beskriver vi montering og implantering av en fiberoptisk for kroniske photostimulation av hjernevev.
Abstract
Belyse mønstre av neuronal tilkoblingsmuligheter har vært en utfordring for både klinisk og grunnleggende nevrovitenskap. Elektrofysiologi har vært gullstandarden for å analysere mønstre av synaptiske tilkobling, men sammenkoblede elektrofysiologiske opptak kan være både tungvint og eksperimentelt begrensende. Utviklingen av optogenetics har innført en elegant metode for å stimulere nevroner og kretser, både in vitro og in vivo en 2,3. Ved å utnytte celle-type promoter aktivitet for å drive opsin uttrykk i diskrete nevronale populasjoner, kan man nettopp stimulere genetisk definerte nevrale subtyper i forskjellige kretser 4-6. Godt beskrevet metoder for å stimulere nevroner, inkludert elektrisk stimulering og / eller farmakologiske manipulasjoner, er ofte celle-type tilfeldig, invasiv, og kan skade omliggende vev. Disse begrensninger kan endre normal synaptiske funksjon og / eller krets atferd. I tillegg, på grunntil arten av manipulasjon, dagens metoder er ofte akutt og terminal. Optogenetics gir evnen til å stimulere nevroner i et relativt ufarlige måte og i genetisk målrettede nevroner. Flertallet av studier som involverer in vivo optogenetics øyeblikket en optisk fiber guidet gjennom en implantert kanylen 6,7, men begrensninger med denne metode skadet hjernevev med gjentatt innsetting av en optisk fiber, og potensielle brekkasje av fiberen inne i kanylen. Gitt den voksende feltet av optogenetics, er en mer pålitelig metode for kronisk stimulering er nødvendig for å rette langtidsstudier med minimal sikkerhet vevsskade. Her har vi gi vårt modifisert protokoll som en video artikkelen å utfylle metoden effektivt og elegant beskrevet i Sparta m.fl.. 8 for fabrikasjon av et fiberoptisk implantat og dets permanente fiksering på kraniet av bedøvede mus, samt monteringen av fiberoptikk coupler kobler implantatet til en lyskilde. Implantatet, koblet med optiske fibre til en solid-state laser, åpner for en effektiv metode for å kronisk photostimulate funksjonell neuronal kretser med mindre vevsskade 9 ved hjelp av små, avtakbare, stagene. Permanent fiksering av de fiberoptiske implantater gir konsistent og langsiktig in vivo optogenetic studier av nevrale kretser i våken, oppfører mus 10 med minimal vevsskade.
Protocol
Discussion
Optogenetics er en kraftig ny teknikk som gjør en enestående kontroll over spesifikke nevronale subtyper. Dette kan utnyttes for å modulere nevrale kretser med anatomisk og tidsmessige presisjon, mens man samtidig unngår celle-type vilkårlig og invasive effekter av elektrisk stimulering gjennom en elektrode. Implantasjon av fiberoptikk gir konsistent, kronisk stimulering av nevrale kretser over flere økter i våken, oppfører mus med minimal skade på vev. Dette systemet, som opprinnelig utviklet av Sparta et …
Acknowledgements
Vi ønsker å erkjenne at denne teknikken ble opprinnelig beskrevet av Sparta et al., 2012 og har vært lett tilpasses for bruk i vårt laboratorium.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
