Fiberoptisk Implantasjon for kronisk Optogenetic Stimulering av hjernevev

Summary

Utviklingen av optogenetics gir nå midler til nettopp stimulere genetisk definerte nevroner og kretser, både

Abstract

Belyse mønstre av neuronal tilkoblingsmuligheter har vært en utfordring for både klinisk og grunnleggende nevrovitenskap. Elektrofysiologi har vært gullstandarden for å analysere mønstre av synaptiske tilkobling, men sammenkoblede elektrofysiologiske opptak kan være både tungvint og eksperimentelt begrensende. Utviklingen av optogenetics har innført en elegant metode for å stimulere nevroner og kretser, både in vitro og in vivo ^{en 2,3.} Ved å utnytte celle-type promoter aktivitet for å drive opsin uttrykk i diskrete nevronale populasjoner, kan man nettopp stimulere genetisk definerte nevrale subtyper i forskjellige kretser ^4-6. Godt beskrevet metoder for å stimulere nevroner, inkludert elektrisk stimulering og / eller farmakologiske manipulasjoner, er ofte celle-type tilfeldig, invasiv, og kan skade omliggende vev. Disse begrensninger kan endre normal synaptiske funksjon og / eller krets atferd. I tillegg, på grunntil arten av manipulasjon, dagens metoder er ofte akutt og terminal. Optogenetics gir evnen til å stimulere nevroner i et relativt ufarlige måte og i genetisk målrettede nevroner. Flertallet av studier som involverer in vivo optogenetics øyeblikket en optisk fiber guidet gjennom en implantert kanylen ^6,7, men begrensninger med denne metode skadet hjernevev med gjentatt innsetting av en optisk fiber, og potensielle brekkasje av fiberen inne i kanylen. Gitt den voksende feltet av optogenetics, er en mer pålitelig metode for kronisk stimulering er nødvendig for å rette langtidsstudier med minimal sikkerhet vevsskade. Her har vi gi vårt modifisert protokoll som en video artikkelen å utfylle metoden effektivt og elegant beskrevet i Sparta m.fl.. ⁸ for fabrikasjon av et fiberoptisk implantat og dets permanente fiksering på kraniet av bedøvede mus, samt monteringen av fiberoptikk coupler kobler implantatet til en lyskilde. Implantatet, koblet med optiske fibre til en solid-state laser, åpner for en effektiv metode for å kronisk photostimulate funksjonell neuronal kretser med mindre vevsskade ⁹ ved hjelp av små, avtakbare, stagene. Permanent fiksering av de fiberoptiske implantater gir konsistent og langsiktig in vivo optogenetic studier av nevrale kretser i våken, oppfører mus ¹⁰ med minimal vevsskade.

Protocol

* Alle materialer sammen med respektive produsenter og / eller leverandører er listet opp nedenfor protokollen.

1. Montering av Implant

1. Lag en blanding av varme-herdbare fiberoptisk epoksy ved å tilsette 100 mg av herder til 1 g av harpiks.
2. Mål og kutt ca 35 mm på 125 mikrometer fiberoptisk med 100 mikrometer kjerne med scoring det med en kile-tip karbid skriver. Plasser den skriftlærde vinkelrett på fiberoptikk og score i en enkel, enveis bevegelse. Kutte fiberen helt vil skade fiberkjemen.
3. Sett inn en LC keramisk ferrul med 127 mikrometer bore seg inn i vice, pekte konvekse siden ned.
4. Sett den fiberoptiske inn hylsen. Den fiberoptiske skal gli inn jevnt og marginalt rage utenfor konvekse ende av hylsen (figur 1a).
5. Påfør en dråpe av varme-helbredelig fiberoptisk epoxy til den flate enden og varme med varmepistol før epoxy blir svart. Epoxy børfylle hylsen som det er oppvarmet og før herding. Epoxy bør kurere innenfor ~ 1 min av konstant varme søknad.
6. Rens bort epoxy langs sidene av hylsen, som det vil blokkere samvirking med kopleren.
7. Polere den konvekse enden av hylsen ved hjelp av en LC fiberoptisk polering plate (FOPD) på aluminiumoksid polering ark på polishing pad (Figur 1b). Gjør sirkulære rotasjon mønstre og polere på fire karakterer i følgende rekkefølge: 5, 3, 1 0,3 mikrometer grus.
8. Skjær den fiberoptiske på den flate enden til passende lengde slik at den er rettet mot regionen av interesse. Lengden kan bestemmes ved hjelp av stereotaksiske atlas.
9. Test implantatet ved å koble den til laser via kopleren ledningen beskrevet nedenfor. Den polerte enden av implantatet inn i hylsen av kopleren og bør få direkte kontakt med den motstående hylsen. Implantatet må være i stand til å opprettholde 10 mW av lyseffekt, målt på spissen av the implantat fiber. En dårlig implantat vil ha et svakt fokuspunkt nær tuppen av den fiberoptiske.
10. Oppbevar de ferdige implantater (figur 1c) i skum før bruk.

2. Montering av fiberoptisk Coupler Cord

1. Lag en blanding av varme-herdbare fiberoptisk epoxy som ovenfor.
2. Mål og kutt en passende lengde på 220 mikrometer fiberoptisk med 200 mikrometer kjerne med scoring det med en kile-tip karbid skriver. Lengden av fiberen bør tillate musen å bevege seg fritt rundt i huset, men ikke lar musen tygge gjennom fiberen.
3. Sett den fiberoptiske inn en lengde av furcation tubing litt lenger enn den fiberoptiske lengde. Slangen bør ha en indre diameter som er litt større enn den fiberoptiske.
4. Strip ~ 25mm i den ene enden av den fiberoptiske og sett den inn i metallet slutten av en Multimode FC MM Ferrule Montering med 230 mikrometer bar til den stopper. Den fiberoptiske bør stikke ut gjennom Ferrule ende (figur 2a).
5. Sikre tilkoblingen med cyanoakrylat (superlim) på metall slutt. Dekk forbindelse med en Connector Boot og polere hylsen enden med en FC FOPD. Gjør sirkulære rotasjon mønstre og polish på fire karakterer i følgende rekkefølge: 5, 3, 1, 0,3 mikrometer grit (Figur 2b).
6. Strippe og sette den andre enden av den fiberoptiske inn en LC keramisk hylse (230 mikrometer id boring) med den konvekse ende distal. Påfør en dråpe epoxy til den flate enden og varme før den er utherdet.
7. Poler konvekse ende av hylsen ved hjelp av en FC FOPD på aluminiumoksid polering ark som beskrevet ovenfor.
8. Skyve en LC ferrule ermet over konvekse ende av hylsen inntil midtpunktet av hylsen.
9. Sted Krympslang over furcation slange og ermet og varme for å sikre og beskytte tilkobling (Figur 2c).
10. Test coupler ved å koble den til laser kilde og måle lyset outpUT gjennom kopleren med et spektrofotometer. Lyset tapet mellom laser utgang og den målte Coupler utgangen skal ikke overskride 30%.

3. Kirurgisk Implantasjon

* Dette er en tips-bare prosedyren. Instrumenter er steril, men hansker trenger ikke å være på grunn av konstant manipulering mellom instrumenter og utstyr.

1. Anesthetize musen med en intraperitoneal injeksjon Ketamin / xylazin blandingen 100 og 10 mg / kg henholdsvis ved hjelp av en 30-gauge nål.
2. Barbere hodebunnen med Clippers. Tørk hodebunnen med 70% isopropylalkohol etterfulgt av Betasept tørke (4% Chlorhexidine løsning) for to minutter, gjenta en gang.
3. Plasser musen i sterotaxic rigg og sikre hodet, slik at hodeskallen er i vater. Påfør ophthalmic sårsalve øynene for å forhindre tørrhet og postoperativ smerte. Opprettholde anestesi ved hjelp volatized isofluran (1-3% fortynnet med oksygen avhengig fysiologiske tilstand mouSE, som bør overvåkes kontinuerlig ved reaksjon på en hale klype).
4. Gjør et snitt gjennom midtlinjen av hodebunnen, utsette kraniet fra øyet baner til lambda. Skyve til side bindevev som nødvendig.
5. Bruk Serafin klemmer til å holde tilbake huden og opprettholde en tilgang til kraniet (Figur 3a).
6. Etch en rutete mønster gjennom hele overflaten av kraniet med en tannlege hakke. Vask støvet bort med sterilt saltvann. Tørk grundig.
7. Påfør hydrogen peroxide (3%) til eksponert kraniet med en bomullspinne for ~ 2-3 sekunder å lage micropores. Vask flere ganger og tørk grundig. Alternativt, kan ankrene bli skrudd inn i kraniet, som beskrevet i Sparta et al. (2012).
8. Igjen, etch et rutemønster i hele kraniet med en tannlege hakke og vaske bort skitt med saltvann. Tørk grundig.
9. Ved hjelp av en roterende verktøy, lage en liten burr hull kraniotomi (<1 mm i diameter) med en steril borkrone(Autoklavert) over regionen av interesse, bestemmes av stereotaksiske atlas kalibrert til bregma og lambda. Vær forsiktig så du ikke ødelegger dura eller skade noen vev. Vask bort rester og tørk grundig.
10. Sett fiberoptisk hylsen (implantat) i sonden holderen og koble til stereotaksiske arm.
11. Plasser implantatet på plass direkte over regionen av interesse ved hjelp av stereotaksiske armen (figur 3b). Hvis innsetting av optisk fiber i hjernevevet, bør fiberen fremskyndes langsomt med en hastighet på ~ 2 mm / min. Hylsen skal hvile på den gjenværende kraniet.
12. Lag en blanding av dental sement. Blandingen bør ha en tilstrekkelig lav viskositet til å enkelt gjelder på tvers kraniet. Blandingen vil være brukbare for 2-4 min.
13. Ved hjelp av en steril tannpirker, påføre et tynt, jevnt lag av dental sement tvers kraniet og på nedre delen av implantatet. Basislaget av dental sement bør dekke så mye areal på kraniet sommulig. Ikke la dental sement kommer i kontakt med huden på mus. Dette vil føre til økt vanskeligheter suturering samt irritasjon til musen. Hvis dental sement kommer i berøring med huden, la det delvis tørke slik at hele laget av sement kan skrelles av før innstillingen.
14. La det tørke helt.
15. Påfør jevne lag av dental sement for å danne en liten forhøyning over kraniet og rundt implantatet, slik at hver lag tørke helt (figur 3c). Forlate ~ 3-5 mm av den konvekse ende av hylsen ren av sement for å tillate en jevn, uhindret forbindelse.
16. Suture hodebunnen over haugen av dental sement og rundt implantatet ved hjelp av sterile, engangsprodukter silke flettet suturer (6-0) med en C22 nål. Fjerne etter 7 dager. Valgfritt: Bruk Vet Bond for ytterligere bindende etter suturering. Pass på å bruke minst mulig Vet Bond. Overskytende kan føre til alvorlig skade på huden på grunn av riper.
17. Immediately etter kirurgi skal musen bli subkutant injisert med Ketprophen (5 mg / kg) for å redusere postoperativ smerte. Dette må gjentas 24 hr senere. Påfør aktuelle analgesi (Bupivicaine) og antibiotika (Neosporin) til sutureres huden og rundt bunnen av implantatet.
18. Plasser musen i et bur over en oppvarming teppe for utvinning fra anestesi. Plasser musen i et sterilt, postoperative utvinning buret. Utvinningen bur skal ikke inneholde noen sengetøy for å opprettholde temperatur og unngå kvelning. Musen kan returneres til den opprinnelige bur eller et nytt bur gang våken.

Riktig montering av den fiberoptiske implantatet og koblingsstengene resulterer i minimal foton tap mellom lyskilden og slutten av den fiberoptiske i regionen av interesse. Godt polert fiberoptikk bør sende lys i en uniform, konsentrisk sirkel (figur 2d). Med forsiktig implantasjon og suturering, forårsaker implantatet ingen synlig irritasjonmus og kan forbli på plass for langsiktige studier (fig. 3d,> 1 måned, upubliserte observasjoner) uten betydelig forringelse av fiberoptisk eller mengden av lys som overføres. Feilaktig implantering eller suturering kan forårsake irritasjon og kan resultere i musen skrape gjennom hodebunnen sin, utsette tannsement, eller brudd på hylsen fra dental sement på grunn av vedvarende manipulasjon. Et skjematisk diagram av den sammenstilte systemet kan ses i figur 4.

Figur 1. Montering av implanterbare fiberoptikk. (A) Den fiberoptiske settes inn i hylsen, marginalt utskytende utover konvekse enden indikert av en pilspiss. (B) Den konvekse ende av hylsen er polert ved hjelp av en FOPD på progressivt finere graderinger av polering ark. (C) Den ferdige implanterbar fiber optic. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Montering av fiberoptisk kopleren brukt å tjore den fiberoptiske roterende ledd til implantatet. (A) Fibertype stikker gjennom hylsen sammenstillingen. (B) Hylsen side av sammenstillingen er innsatt i FOPD og polert ved hjelp av progressivt finere graderinger av polering papir. (C) Hylsen hylsen er montert over hylsen og sikret med krympeslange. (D) Den ferdige fiberoptisk kopleren skal produsere en konsentrisk lys med minimal foton tap.

Figur 3. Kirurgisk implantering av fiberoptikk. (A) Hele overflaten av cranium er utsatt for og bindevev er fjernet. (B) Den fiberoptiske implantatet holdes i posisjon med den stereotaksiske armen. (C) Dental sement påføres fikse fiberoptisk implantatet til kraniet. (D)> 1 måned etter implantering, har huden helbredet rundt implantatet og det er ingen tegn på irritasjon.

Figur 4. Skjematisk diagram av funksjonelt system

Discussion

Optogenetics er en kraftig ny teknikk som gjør en enestående kontroll over spesifikke nevronale subtyper. Dette kan utnyttes for å modulere nevrale kretser med anatomisk og tidsmessige presisjon, mens man samtidig unngår celle-type vilkårlig og invasive effekter av elektrisk stimulering gjennom en elektrode. Implantasjon av fiberoptikk gir konsistent, kronisk stimulering av nevrale kretser over flere økter i våken, oppfører mus med minimal skade på vev. Dette systemet, som opprinnelig utviklet av Sparta et al. ⁸ og endret for å passe vårt formål, går ett skritt lenger enn den implanterte kanylen og løser den fiberoptiske på plass i regionen av interesse å sikre konsekvent målretting mellom økter i langtidsstudier. Implantater kan tilpasses å stimulere forskjellige regioner av hjernen.

Ulike trinnene i denne metoden krever presisjon og oppmerksomhet på detaljer. Hvert veikryss av fiberoptisk kobling ernødvendigvis polert for å sikre minimal lystap. Etter polering, skal endene undersøkes under et mikroskop for å verifisere at det ikke er noen skade på fiberkjemen. Hvis lystap mellom kilden og den målte produksjon overstiger 30%, skal hver del repolished å tillate maksimalt foton flux eller den delen må kastes og gjenskapt. Hvis hylsen ikke glir inn i hylsen, er det sannsynlig rusk inni hylsen obstructing hylsen. Når feste og fjerne Coupler ledningen til implantatet, bør kraften brukes direkte parallelt med aksen av implantatet. Grunnet det faktum at pattedyrvev sprer lys tungt og det relativt lave energien av blått lys, bør implantatet plasseres slik at spissen av fiberen er innenfor 500 mikrometer av regionen av interesse, hvor> 10% av opprinnelig lys effekttetthet vedvarer ^6. Under implanteringen er basislaget av dental sement den kritiske trinn, som det er dette laget som fester implantatet til Cranium. De etterfølgende lagene sikrer implantatet til basislaget og gi beskyttelse. Underlaget vil ikke følge godt hvis kraniet ikke er helt tørt, hvis noen del ikke er overholdt godt, er det sannsynlig at manipulasjon fra musen vil løsne hele implantatet. Alternativt kan ankere for dental sement skrus inn i kraniet for en mer sikker ligaen.

I atferdsstudier, kan eksternt lys lekkasje gi en utilsiktet kø til musen. Eksternt lys lekkasjen er mest sannsynlig skje på sammenhengen mellom implantatet og kopleren ledningen direkte over musen. For å minimere lyslekkasje kan varmekrympingsrør bli ytterligere utvidet slik at det helt dekker hylsen ermet å gi ekstra skjerming mot lekkasje. Hvis dette alternativet er forfulgt, vil varmekrympingsrør dekke vinduet i ermet som gir visuell tilbakemelding for direkte kontakt mellom endehylser og kontakt bør bestemmes med taktile avgiftdback.

Mot videreutvikling av denne teknikken, er det mulig å implantere flere fiberoptikk til en enkelt mus ved hjelp av flere stereotaksiske armene, som beskrevet i Sparta m.fl. ^8. Dette ville muliggjøre mer komplekse studier gjennom differensial bølgelengde stimulering i samme region i en tidsmessig bestemt måte eller samtidig stimulering av ulike regioner. I tillegg kan fiberoptikk være kombinert med elektroder (optrode) for in vivo elektrofysiologi for lokal stimulering og registrering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LC Ferrule Sleeve	Precision Fiber Products (PFP)	SM-CS125S	1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector	PFP	MM-CON2004-2300	230 μm Ferrule
FC MM Pre-Assembled Connector	PFP	MM-CON2004-2300	230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc	PFP	M1-80754	For LC ferrules
Furcation tubing	PFP	FF9-250	900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm	PFP	MM-FER2007C-1270	127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm	PFP	MM-FER2007C-2300	230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin	PFP	ET-353ND-16OZ
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk	ThorLabs	D50-FC	For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	Spectrophotometer
Polishing Pad	ThorLabs	NRS913	9" x 13" 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits	ThorLabs	LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
Standard Hard Cladding Multimode Fiber	ThorLabs	BFL37-200	Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool	ThorLabs	T10S13	Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber	Polymicro Technologies	FVP100110125	High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1x1 Fiberoptic Rotary Joint	doric lenses	FRJ_FC-FC
Mono Fiberoptic Patchcord	doric lenses	MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
Heat shrink tubing, 1/8 inch	Allied Electronics	689-0267
Heat gun	Allied Electronics	972-6966	250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
VetBond tissue adhesive	Fischer Scientific	19-027136
Flash denture base acrylic	Yates Motloid	ColdPourPowder+Liq
BONN Miniature Iris Scissors	Integra Miltex	18-1392	3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Integra Miltex	7-290	1-1/2"(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor	Vector	EL-S
Panther Burs-Ball #1	Clarkson Laboratory	77.1006
Violet Blue Laser System	CrystaLaser	CK473-050-O	Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply	CrystaLaser	CL-2005
Dumont #2 Laminectomy Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Probe	Fine Science Tools	10140-02
5"Straight Hemostat	Excelta	35-PH
Vise with weighted base	Altex Electronics	PAN381