Summary
Optogenetics gelişimi artık kesin tanımlı genetik nöronlar ve devreler uyarmak için araç, hem de sağlar
Abstract
Sinirsel bağlantıda durulaştırmada desenleri klinik ve temel hem nörobilim için bir meydan okuma olmuştur. Elektrofizyoloji sinaptik bağlantı desenleri analiz etmek için altın standart olmuştur, ama eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar hantal ve deneysel sınırlayıcı hem de olabilir. Optogenetics gelişimi in vitro ve in vivo 1 2,3 hem de nöronlar ve devreler uyarmak için zarif bir yöntem tanıttı. Ayrık nöronal popülasyonlarda opsin ifade sürücü hücre tipi spesifik promotor aktivitesi istismar ederek, tek bir doğrusu farklı devreleri 4-6 tanımlı genetik nöronal alt uyarabilir. Elektrik stimülasyonu ve / veya farmakolojik manipülasyonlar dahil nöronlar, teşvik etmek de anlatılan yöntemlerin sık sık invaziv hücre tipi ayrım vardır ve çevre dokulara zarar verebilir. Bu sınırlamalar, normal sinaptik fonksiyon ve / veya devrenin davranışını değiştirebilir. Bunlara ilave olarak,manipülasyon doğası, mevcut yöntemleri sıklıkla akut ve terminal vardır. Optogenetics nispeten zararsız bir şekilde nöronları uyarır, ve genetik olarak hedeflenen nöronlarda olanağı tanıyor. In vivo olarak optogenetics içeren çalışmaların çoğu şu anda bir kanül implant 6,7 yönlendirilirler bir optik fiber kullanmak, ancak bu yöntem sınırlamalar bir optik fiber tekrarlanan ekleme ile hasarlı beyin dokusu, ve kanül içinde fiberin kırılma potansiyeli vardır. Optogenetics arasında gelişen alanda göz önüne alındığında, kronik stimülasyon daha güvenilir bir yöntemle daha az teminat doku hasarı ile uzun vadeli çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir. Burada, etkili ve şık bir Sparta ve ark anlatılan yönteme tamamlamak için bir video madde olarak modifiye protokol sağlar. 8 anestetize farelerin kafatası üzerine bir fiber optik implant ve kalıcı tespit üretiminde, hem de in tertibatı için lifoptik bağlantı elemanı bir ışık kaynağına implant bağlayan. Bir katı hal lazer fiber optik ile bağlı implant, kronik az doku hasarı 9 küçük, çıkarılabilir, iplerini kullanarak işlevsel nöronal devreler photostimulate için etkili bir yöntem sağlar. Fiber optik implantlar Daimi fiksasyon sağlar tutarlı, minimal doku hasarı olan 10 uyanık, davranmasıyla farelerde nöronal devrelerin vivo optogenetic çalışmalarda uzun vadeli.
Protocol
Ilgili üretici ve / veya satıcıları ile birlikte * Bütün malzemeler protokolü aşağıda listelenmiştir.
1. İmplant Meclisi
- 1 g reçine ile sertleştirici 100 mg eklenmesi ile ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın.
- Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama ile 100 mikron çekirdek ile optik 125 mikron fiber yaklaşık 35 mm kesti. Tek, tek yönlü hareket fiber optik ve skoru katip dik yerleştirin. Fiber Kesme tamamen fiber çekirdek zarar verecektir.
- Yardımcısı içine taşıyan bir 127 mikron olan yüksük bir LC seramik yerleştirin, dışbükey tarafı aşağı çekti.
- Halka içine optik lif yerleştirin. Optik lif sorunsuz slayt ve marjinal halka (Şekil 1a) konveks sonunu çıkıntı yapmalıdır.
- Epoksi siyah olana kadar ısı tabancası ile düz ucunu ve ısı ısı kurutmalı fiber optik epoksi bir damla uygulayın. Epoksi gerekirısıtılan ve daha önce kür olarak halka doldurun. Epoksi sabit ısı uygulaması ~ 1 dk içinde tedavi edilmelidir.
- Bu bağlantı elemanı ile arabirim engelleyici olarak, halka yanları boyunca herhangi bir epoksi temizleyin.
- Parlatma pedi üzerine alüminyum oksit parlatma yaprak (Şekil 1b) bir LC fiber optik parlatma diski (FOPD) kullanarak halka ve dışbükey sonuna Lehçe. Dairesel dönme desenleri olun ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe: 5, 3, 1 0.3 mikron kum.
- İlgilenilen bölge hedef alan bu gibi uygun uzunlukta düz sonunda optik fiber kesin. Uzunluk, stereotaksik atlası kullanılarak tespit edilebilir.
- Aşağıda açıklanan bağlayıcı kablosu üzerinden lazer bağlayarak implant sınayın. İmplantın cilalı ucu manşonun kol takılan ve karşıt halka ile doğrudan temas yapmak gerekir. İmplant inci ucunda ölçülen ışık çıkışı 10 mW korumak gerekire implant lif. Kötü bir implant optik fiber ucuna yakın bir zayıf bir odak noktası olacaktır.
- Kullanıma kadar köpük içinde bitmiş implantlar (Şekil 1c) saklayın.
2. Fiber Optik çoğaltıcı Kordon Meclisi
- Yukarıdaki gibi ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın.
- Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama 200 mikron çekirdek ile optik 220 mikron fiber uygun uzunlukta kesilir. Lif uzunluğu fare gövde etrafında serbestçe hareket etmesine izin verir ama fare elyaf ile çiğnemek izin verilmemelidir.
- Optik lif uzunluğu biraz daha uzun dallanma borusunun bir uzunluk içine optik fiber ekler. Tüp optik fiber biraz daha büyük bir iç çapa sahip olmalıdır.
- Şerit ~ 25mm optik fiber bir ucunda ve Multimode FC MM metal uç takın durana kadar 230 mikron deliği ile Meclis Yüksük. Optik fiber ferru dışarı sopa gerekirle sonu (Şekil 2a).
- Metal sonunda (süper yapıştırıcı) siyanoakrilat ile bağlantıyı sabitleyin. Bağlayıcı Boot ile bağlantı örtün ve FC FOPD ile halka sonuna parlatın. 5, 3, 1, 0.3 mikron grit (Şekil 2b): dairesel dönme desen ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe olun.
- Distal konveks uç ile bir LC seramik halka (230 um id oyuğu) içine optik fiber diğer ucunu soyun ve yerleştirin. Kürlenmeden düz uç ısı ve epoksi bir damla uygulayın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi alüminyum oksit parlatma levhalar üzerinde bir YP FOPD kullanarak halka ve dışbükey uç parlatmak.
- Kol orta noktası kadar halka ve dışbükey ucu üzerinde bir LC halkalı kol getirin.
- Sıra ısı shrink furkasyon boru ve bağlantı (Şekil 2c) güvenliğini sağlamak ve korumak için kol ve ateşte tüp.
- Lazer kaynağı bağlayarak ve ışığı outp ölçerek bağlayıcı sınayınbir spektrofotometre ile bağlantı yoluyla ut. Lazer çıkışı ve ölçülen coupler çıkış arasındaki ışık kaybı% 30 geçmemelidir.
3. Cerrahi implantasyon
* Bu bir ipucu, yalnızca bir işlemdir. Aletleri steril ama eldiven alet ve ekipmanlar arasında sürekli manipülasyon nedeniyle olması gerekmez.
- Intraperitoneal enjeksiyon Ketamin / Ksilazin karışım, 100 ve 30-gauge iğne kullanılarak sırasıyla 10 mg / kg ile fare anestetize.
- Makası ile kafa derisi Tıraş. Betasept kez tekrarlayarak, iki dakika süreyle (% 4 çözelti Klorheksidin) mendil, ardından% 70 izopropil alkol ile kafa derisi temizleyin.
- Sterotaxic teçhizat fare yerleştirin ve kafatası düzeyde olmasını sağlamak, kafa sabitleyin. Kuruluk ve postoperatif ağrıyı önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulayın. Oksijen mou fizyolojik durumuna bağlı olarak seyreltildi buharlaşmasına izofluran (% 1-3 ile anestezi koruyunsürekli bir kuyruk tutam yanıt takip edilmelidir se,).
- Lambda göz yörüngede kafatası açığa derisi orta hat boyunca bir kesi olun. Gerektiği gibi bağ dokusu bir kenara itin.
- Cilt geri tutmak için Serafin kelepçeleri kullanın ve kafatası (Şekil 3a) bir erişim sağlamak.
- Bir diş çekme ile kafatası yüzeyi boyunca etch bir damalı deseni. Steril serum fizyolojik ile pislikleri dışarı yıkayın. Iyice kurulayın.
- Mikrogözenekler oluşturmak için ~ 2-3 saniye için bir pamuklu bezle maruz kafatasına hidrojen peroksit (% 3) uygulayın. Birden çok kez yıkayın ve iyice kurulayın. Sparta ve ark tarif edildiği gibi Alternatif olarak, ankraj, kafatası içine vidalanabilir. (2012).
- Yine, etch bir kareli bir diş çekme ile kafatası boyunca desen ve salin ile enkaz yıkayacak. Iyice kurulayın.
- Döner aracını kullanarak, steril bir matkap ucu ile küçük bir burr hole kraniotomi (çapı <1 mm) yapmak(Otoklav) Yukarıdaki bregma ve lambda kalibre stereotaksik atlas tarafından belirlenen faiz bölge. Dura kırmak veya herhangi bir dokuya zarar vermemek için dikkatli olun. Enkaz uzak yıkayın ve iyice kurulayın.
- Prob tutucu içine fiber optik halka (implant) takın ve stereotaksik koluna bağlayın.
- Doğrudan doğruya stereotaksik kol (Şekil 3b) kullanılarak ilgi bölgesi üzerinde yerinde implant yerleştirin. Beyin dokusu içinde optik fiber ekleme, fiber ~ 2 mm / dak 'lık bir hızla ağır ağır geliştirilmesi gerekmektedir. Ferrül kalan kafatası dayanması gerektiğini.
- Diş çimento karışımı hazırlayın. Karışım kolayca kafatası boyunca uygulamak için yeterince düşük bir viskoziteye sahip olmalıdır. Karışım 2-4 dakika için kullanılabilecektir.
- Steril bir kürdan kullanarak, kafatası boyunca ve implantın alt kısmı üzerine diş çimentosu, bir ince, düz bir tabaka uygulanır. Olarak diş çimento temel tabakası kafada kadar yüzey alanı kapsamalıdırmümkündür. Fare deri ile temas diş çimento izin vermeyin. Bu artan dikilmesi zorluk hem de fare tahrişe yol açacaktır. Diş çimento deri ile temas etmezse, kısmen çimento Tüm katmanı ayarı önce kapalı soyulmuş olabilir böyle kurutun.
- Tamamen kurumasını bekleyin.
- Her katmanın (Şekil 3c) tamamen kurumasını sağlayan, kafatası üzerinde ve implant çevresindeki küçük bir höyük oluşturmak için diş çimento bile kat kat uygulayın. Pürüzsüz, engelsiz bağlantı sağlamak için çimento temiz halka ve dışbükey sonu ~ 3-5 mm bırakın.
- Diş çimento höyük üzerinde ve C22 iğne ile steril, tek kullanımlık ipek örgülü sütür (6-0) kullanarak implant çevresindeki derisi dikin. 7 gün sonra çıkarın. İsteğe bağlı: sütür sonra ek bağlama için kullanın Vet Bond. Minimal Vet Bond kullandığınızdan emin olun. Aşırı kaşıma nedeniyle ciddi cilt hasarına yol açabilir.
- Immediatelameliyat sonrası y, fare deri altından sonrası ağrıyı azaltmak Ketprophen (5 mg / kg) ile enjekte edilmelidir. Bu 24 saat sonra tekrarlanmalıdır. Implantın tabanı sütüre cilde ve çevresinde topikal analjezikler (bupivakain) ve antibiyotik (Neosporin) uygulayın.
- Derlenme için ısıtma battaniye üzerinde bir kafes içinde fare yerleştirin. Steril, ameliyat sonrası iyileşme kafesteki fare yerleştirin. Kurtarma kafes ısısını korumak ve boğulma önlemek için herhangi bir çarşaf içermemelidir. Fare orijinal kafes veya bir kez uyanık, yeni bir kafes iade edilebilir.
Işık kaynağı ve ilgi bölgesi içinde optik fiber uç arasında en az foton kaybı fiber optik implant ve manşon sonuç Uygun montaj. İyi cilalanmış fiber optik bir üniforma, konsantrik dairenin (Şekil 2d) ışık iletimi gerekir. Dikkatli implantasyon ve sütür ile implant gözle görülür hiçbir tahrişe nedenfare ve optik fiber veya iletilen ışık miktarının önemli bir bozulma olmadan uzun vadeli çalışmalar (Şekil 3d,> 1 ay, yayınlanmamış gözlemler) yerinde kalabilir. Uygun olmayan emplantasyon ya da dikişin tahriş olmasına neden olabilir ve nedeniyle sürekli manipülasyon diş çimentosu, çimento veya diş olan halka kırılması ortaya çıkaracak olan kafa derisi ile kazıma fare neden olabilir. Birleştirilen sisteminin şematik bir diyagramı Şekil 4'te görülebilir.
Şekil 1. Implante fiber optik Meclisi. (A) optik elyaf marjinal ok başı ile gösterilen uç ötesinde çıkıntı yapan dışbükey, yüksük içine yerleştirilir. (B) halka ve dışbükey sonu parlatma yaprak kademeli ince sınıflarda bir FOPD kullanılarak parlatılır. (C) mamul implante lif optic. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Implanta tether fiber optik döner eklem için kullanılan fiber optik bağlantı elemanı montajı. Halkalı montaj yoluyla (a) Fiber optik yapışıyor. (B) grubunun halkalı yan parlatma kağıdı kullanılarak FOPD ve parlak kademeli ince dereceleri içine yerleştirilir. (C) halka kovanı halka üzeri ve ısı shrink boru ile güvence altına alınır. (D) bitmiş fiber optik bağlantı elemanı minimum foton kaybı ile eşmerkezli bir ışık üretmek olmalıdır.
Şekil 3. Cerrahi implantasyon fiber optik. Craniu (a) tüm yüzeyim maruz kalmakta ve bağ dokusu temizlenir. (B) optik fiber implant steryotaksik bir kol ile bir konumda tutulur. (C) Diş çimento kafatasına fiber optik implant sabitleme uygulanır. (D) implantasyonu sonrası> 1 ay, cilt implant çevresindeki iyileştikten ve irritasyon bulguları vardır.
Şekil 4. Fonksiyonel sisteminin şematik diyagramı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetics spesifik nöronal alt üzerinde benzersiz kontrol sağlayan yeni ve güçlü bir tekniktir. Bir elektrot aracılığıyla hücre tipi gelişigüzel ve elektriksel stimülasyon invaziv etkilerden kaçınarak Bu, anatomik ve zamansal hassas sinir devreleri modüle istismar edilebilir. Fiber optik İmplantasyonu dokuya en az zarar ile farelerin davranmak, uyanık birden fazla seans nöral devrelerin tutarlı, kronik stimülasyon sağlar. Bu sistem, aslında Sparta ark tarafından öncülük etmiştir. 8 ve bizim amaçlarımız uyacak şekilde değiştirilmiş, implante kanül bir adım öteye gidiyor ve uzun vadeli çalışmalarda oturumları arasında hedefleme tutarlı sağlamak için ilgi bölgede yer optik fiber giderir. Implantlar, beynin farklı bölgelerinde teşvik etmek için adapte edilebilir.
Bu yöntem içinde çeşitli adımlar detaylara hassasiyet ve dikkat gerektirir. Fiber optik bağlantı her kavşakille minimum ışık kaybı sağlamak için parlatılır. Polisaj sonrası biter fiber çekirdek herhangi bir hasar olduğunu doğrulamak için bir mikroskop altında incelenmelidir. Kaynak ve çıkışı arasındaki ölçülen ışık kaybı% 30 oranında aştığı takdirde, her bir parça en fazla foton akış ya da kısmen atılmalıdır izin vermek ve yeniden yapılan için repolished olmalıdır. Ferrül kol içine kaymıyorsa, halka tıkayan kol içindeki muhtemel enkaz var. Bağlanması ve implant ile bağlayıcı kablosunu çıkarırken, kuvvet implant eksenine paralel direkt olarak uygulanabilir. Ağır memeli doku dağılır ve mavi ışık nispeten düşük enerji, implant fiberin uç ilgi bölgesi, bir 500 mikron içinde olacak şekildedir yerleştirilmiş olmalıdır olması nedeniyle, burada ilk ışık enerji yoğunluğu>% 10 6 devam. Bu vinçler ile gideren implant bu tabaka olarak implantasyon sırasında, diş çimentosu taban katmanı, önemli bir adımdırium. Bunu takip eden katmanlara baz tabaka için implant güvenli ve koruma sağlar. Kafatası tamamen kuru değilse temel tabakası iyi yapışmaz; herhangi bir bölümünde iyi yapışmış değilse, o fare manipülasyon tüm implantı çıkarmak olasıdır. Alternatif olarak, diş çimento için çapa daha güvenli bir fikstür için kafatası monte edilebilinir.
Davranışsal çalışmalarda, dış ışık sızıntısı fare istenmeyen bir ipucu verebilir. Harici ışık sızıntısı doğrudan fare üzerinde implant ve bağlayıcı kablosu arasındaki bağlantıyı da ortaya en olasıdır. Işık sızıntısını en aza indirmek için, ısı ile büzülen tüp daha da tamamen sızıntı karşı koruma sağlamak için ilave halkalı kol kapsar ki bu tür uzatılabilir. Bu seçeneği takip edilirse, ısı shrink boru kovanlar ve iletişim arasında doğrudan temas için görsel geribildirim sağlar kol penceresi karşılayacaktır dokunsal ücreti ile tespit edilmelidirdback.
Bu tekniğin daha da geliştirilmesi yönünde, bu gibi Sparta ve ark 8'de tarif edildiği gibi ilave stereotaksik kolları kullanılarak tek bir fare üzerine birden fazla fiber optik implante etmek mümkündür. Bu geçici belirli bir şekilde veya farklı bölgelerde aynı anda uyarılması aynı bölgede diferansiyel dalga stimülasyon yoluyla daha karmaşık çalışmaları sağlayacaktır. Buna ek olarak, fiber optik lokal uyarılması için ve kayıt vivo Elektrofizyolojide için elektrotlar (optrode) ile akuple edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bu tekniği aslında Sparta ve ark., 2012 tarafından tanımlanmış ve kolayca laboratuar kullanım için adapte edildiğini kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K.
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
