שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.
בדיקה ניסיונית של תא התנהגות נורמלית אנושית חלב אפיתל (HMEC), וכיצד תאים רגילים לרכוש נכסים חריגים, ניתן בהנחייתם של מערכות תרבות במבחנת שמודל מדויק יותר בביולוגית vivo. השימוש בחומר אנושי הנגזר ללימוד התמיינות תאים, הזדקנות, הזדקנות, והנצחה הוא יתרון במיוחד בהתחשב בהבדלים הרבים המולקולריים המשמעותיים בנכסים אלה בין תאי מכרסמי אדם ובדרך כלל מנוצלים 1-2. תאי חלב להציג מערכת מודל נוחה בגלל כמויות גדולות של רקמות נורמליות ולא נורמליות זמינות בשל התדירות מאמופלסטית צמצום וניתוחי כריתת שד.
בלוטת החלב מורכב מתערובת מורכבת של סוגים רבים שונים של תאים,, שומן למשל, אפיתל, mesenchymal, אנדותל. תאי האפיתל הם אחראים לתפקוד החלב המובדל של הנקה,והם גם מקורו של הרוב המכריע של מקרי סרטן שד בנשים. פתחנו שיטות לעיבוד רקמות התעלמות ניתוחית בלוטת חלב למרכיבי אפיתל טהורים כמו גם תאי mesenchymal 3. החומרים מעובדים יכולים להיות מאוחסנים קפוא ללא הגבלה זמן, או באופן יזום לתרבות העיקרית. חומרים שנזרקו כירורגים מועברים למעבדה וידנית גזור להעשרה לרקמות המכילות אפיתל. לאחר עיכול של הרקמה הגזורה באמצעות רצועות חומרי סטרומה hyaluronidase collagenase ומepithelia בקרום המרתף. את החתיכות הקטנות של העץ נובעים אפיתל (organoids) ניתן להפריד stroma עיכול על ידי סינון רציף על קרומים של גודל נקבובי קבוע. בהתאם לגודל נקבובי, שברים ניתן להשיג בהיקף של חתיכות גדולות יותר ductal / מכתשיים, צבירי מכתשיים קטנים יותר, או בתאי סטרומה. אנו צפינו צמיחה מעולה כאשר תרבויות הם יזמו כorganoids לא כדיסתאים בודדים sociated. מיקום של organoids בתרבות באמצעות תקשורת ישכנע מתח נמוך תומך בצמיחה לטווח הארוך של HMEC הנורמלי עם סמנים של סוגי שושלת מרובים (,, מוליד luminal myoepithelial) 4-5. כמות מספקת של תאים ניתן להשיג מרקמות של אדם אחד כדי לאפשר בדיקה ניסיונית נרחבת באמצעות קבוצות סטנדרטיות סלולריות, כמו גם חקירה באמצעות שיטות תפוקה גבוהות.
HMEC התרבותי שהוא מועסק במגוון רחב של מחקרים הבוחנים את התהליכים הרגילים המסדירים את הצמיחה, התמיינות, הזדקנות, והזדקנות, וכיצד תהליכים נורמלים אלו שונו במהלך שינוי האלמותי וממאירים 4-15,16. ההשפעות של גידול בנוכחות של חומר חוץ תאי מטריצה, סוגי תאים אחרים, ו / או תרבות 3D יכולות להיות לעומת צמיחה ב5,15 פלסטיק. HMEC התרבותי, החל בתאים נורמלים, מספק מערכת ניסויית צייתנית לבחון גורמים העשוי להניע או למנוע הזדקנות אנושית וגידולים ממאירים.
השיטה אנושי רקמת שד העיבוד המוצג כאן מאפשרת קבלת תאי האפיתל חלב טהורים מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים בשד האנושי. סינון הדרך נקבובית של גודל קבוע מאפשר פרדה של שברים שונים של בלוטת החלב (למשל, ductal וductal-מכתשיים לעומת מכתשיים) ממטריצת סטרומה מעוכלת. fibroblasts החלב Isogenic ניתן להשיג כדי שיתאים לתאי האפיתל. חומרים מעוכלים קפוא שמרה כדאיות טובה במשך 30 שנים. שיטה זו עבדה בהצלחה בכל אבל רקמת שד מאוד סיבית, והוא קל לביצוע. וריאציות אחרות של עיבוד רקמת שד קיימות שאינם מספקים שברי האפיתל שנמצאים כבת קיימא, נקיים, או פרודים. מיקום של organoids מעובד בתרבות עם לחץ תקשורתי וישכנע נמוכים כגון M87A מאפשר צמיחה לטווח הארוך של HMEC עם סמני שושלת מרובים. HMEC כי כבר בתרבית על פלסטיק עדיין שומר על יכולת generaמבני te 3D עם נורמלי ביחסי שושלת vivo דמויים. תרבויות HMEC אלו מתאימים לחקירה מקיפה ניסיונית, כולל תפוקה גבוהה, התנהגות HMEC נורמלית וגורמים שעשויים להניע או לעכב הזדקנות ושינוי.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, ונתמכת על ידי גברת NIA (R00AG033176 וR01AG040081) ועל ידי מעבדת מחקר ופיתוח בימוי, ארה"ב מחלקת אנרגית החוזה # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |