Une méthode pour traiter humaine matériau mammaire chirurgicale est décrite de défausse. Tissu traité, sous la forme d'organites, peuvent être conservés congelés indéfiniment ou mis en culture pour la croissance à long terme. Cette méthode permet d'examiner expérimentale de biologie cellulaire normale épithéliale humaine, et les effets des perturbations exogènes.
Examen expérimental des cellules mammaires humaines normales (HMEC) épithélial comportement, et comment les cellules normales acquérir des propriétés anormales, peut être facilitée par des systèmes de culture in vitro de façon plus précise le modèle en biologie in vivo. L'utilisation de matières provenant de l'homme pour l'étude de la différenciation cellulaire, le vieillissement, la sénescence et l'immortalisation est particulièrement avantageux étant donné les nombreuses et importantes différences moléculaires dans ces propriétés entre les cellules de rongeurs et de l'homme couramment utilisé 1-2. Les cellules mammaires présentent un système modèle très pratique car de grandes quantités de tissus normaux et anormaux sont disponibles en raison de la fréquence de réduction mammaire et la chirurgie mastectomie.
La glande mammaire est constituée d'un mélange complexe de nombreux types cellulaires distincts, par exemple, l'épithélium, tissu adipeux, mésenchymateuses, endothéliales. Les cellules épithéliales sont responsables de la fonction différenciée mammaire de la lactation,et sont aussi à l'origine de la grande majorité des cancers du sein. Nous avons développé des méthodes pour traiter les tissus mammaires glande rejets chirurgicales en pures composants épithéliaux ainsi que des cellules mésenchymateuses 3. La matière traitée peuvent être conservés congelés indéfiniment, ou initié à la culture primaire. Matière de défausse chirurgicale est transporté au laboratoire et manuellement disséqué pour enrichir le tissu épithélial contenant. Digestion ultérieure du tissu découpé à l'aide de la collagénase et la hyaluronidase matériau des bandes de stroma de l'épithélium à la membrane basale. Les pièces résultant de petits épithélial de l'arbre (organites) peut être séparé du stroma digéré par filtration séquentielle sur des membranes de porosité fixe. Selon la taille des pores, les fractions peuvent être obtenues composé de grandes canalaires / alvéolaire pièces, des grappes plus petites alvéoles ou cellules stromales. Nous avons observé une croissance supérieure lorsque les cultures sont initiées comme organites plutôt que comme dissociated cellules individuelles. Placement des organites dans la culture en utilisant les médias induisant peu de stress en charge à long terme la croissance des HMEC normale avec des marqueurs de la lignée types multiples (myoépithéliales, luminal, l'ancêtre) 4-5. Un nombre suffisant de cellules peuvent être obtenues à partir de tissus d'un individu pour permettre vaste examen expérimental utilisant des lots de cellules standardisées, ainsi que d'interrogatoire selon des modalités à haut débit.
HMEC culture ont été utilisés dans une grande variété d'études sur les processus normaux qui régissent la croissance, la différenciation, le vieillissement et la sénescence, et comment ces processus normaux sont modifiés au cours de la transformation maligne immortelle et 4-15,16. Les effets de la croissance en présence d'un matériau de matrice extracellulaire, d'autres types cellulaires et / ou la culture 3D peuvent être comparées avec la croissance sur 5,15 plastique. HMEC culture, à commencer par les cellules normales, apporter à un système expérimental maniable pour examiner les facteurs quipeut propulser ou prévenir le vieillissement humain et la cancérogenèse.
La méthode humaine de traitement des tissus mammaires présentée ici permet d'obtenir pures cellules épithéliales mammaires à partir du mélange hétérogène de types de cellules dans le sein humain. Filtration au travers des pores de taille fixe permet la séparation des différentes fractions de la glande mammaire (par exemple, des canaux et canalaire contre-alvéolaire alvéolaire) de la matrice digéré stroma. Isogéniques fibroblastes mammaires peuvent être obtenues pour correspondre aux cellules épithéliales. Frozen matière digérée a conservé une bonne viabilité pendant plus de 30 ans. Cette méthode a fonctionné avec succès sur tous, mais très fibreuses tissus mammaires, et est simple à réaliser. D'autres variantes de traitement des tissus mammaires existent qui ne fournissent pas de fractions épithéliales qui sont aussi viables, propres ou séparés. Placement des organites transformés en culture avec de faibles inducteurs de stress médias tels que M87A permet croissance à long terme du HMEC avec des marqueurs de la lignée multiples. HMEC qui ont été cultivées sur plastique tout en conservant la capacité de générationte des structures 3D avec la normale dans les relations lignagères vivo similaires. Ces cultures HMEC conviennent pour une étude expérimentale approfondie, y compris à haut débit, d'un comportement normal et HMEC facteurs qui peuvent propulser ou inhiber la sénescence et de la transformation.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, et MRS sont pris en charge par la NIA (R00AG033176 et R01AG040081) et par le Laboratoire Directed Research and Development, US Department of Energy contrat # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |