En fremgangsmåde til at behandle human mammae kirurgisk skille materiale beskrives. Behandlet væv, i form af organoids, kan opbevares frosset ubestemt tid eller anbringes i kultur i langsigtet vækst. Denne metode giver mulighed eksperimentel undersøgelse af normal human epitel cellebiologi, og virkningerne af udefra kommende forstyrrelser.
Eksperimentel undersøgelse af normal human mammae epitelceller (HMEC) adfærd, og hvor normale celler erhverver abnorme egenskaber, der kan lettes ved in vitro-dyrkningssystemer, der mere præcist model in vivo biologi. Anvendelsen af humant afledte materiale til undersøgelse af cellulær differentiering, aldring, ældning og immortalisering er særlig fordelagtig i betragtning af de mange vigtige molekylære forskelle mellem disse egenskaber mellem humane og almindeligt anvendte gnaverceller 1-2. Mammae celler udgør en bekvem model system, fordi store mængder af normale og unormale væv er tilgængelige på grund af hyppigheden af reduktion mammoplasty og mastektomi kirurgi.
Mælkekirtlen består af en kompleks blanding af mange forskellige celletyper, fx epitel-, fedt-, mesenchymal, endotel. Epitelcellerne er ansvarlige for differentierede mammary funktion af laktation,og er også oprindelsen af størstedelen af humane brystcancere. Vi har udviklet metoder til at behandle brystkirtel kirurgiske udsmid væv til rene epithelceller komponenter såvel som mesenchymale celler 3. Det bearbejdede materiale kan opbevares frosset på ubestemt tid, eller initieret i primær kultur. Kirurgisk skille materialet transporteres til laboratoriet og manuelt dissekeret for at berige for epitel-indeholdende væv. Efterfølgende fordøjelse af det dissekerede væv med collagenase og hyaluronidase strimler stromal materiale fra epitelet ved basalmembranen. De resulterende små stykker af epitel træet (organoids) kan adskilles fra det fordøjede stroma ved sekventiel filtrering på membraner af faste porestørrelse. Afhængig af porestørrelsen, kan fraktioner opnås der består af større duktale / alveolære stykker, mindre alveolære klynger, eller stromale celler. Vi har observeret overlegen vækst, når kulturer indledt som organoids snarere end som disknyttede enkeltceller. Placering af organoids i kultur ved hjælp af lav-stress inducerende medier understøtter en langsigtet vækst i normal HMEC med markører for flere afstamning typer (myoepithelial, luminal, stamfader) 4-5. Et tilstrækkeligt antal celler kan opnås fra et individs væv for at tillade omfattende eksperimentel undersøgelse ved hjælp af standardiserede celle batches samt interrogationssignaler med højt gennemløb modaliteter.
Cultured HMEC har været ansat i en lang række undersøgelser af de normale processer, der styrer vækst, differentiering, aldring og alderdom, og hvordan disse normale processer ændres under det udødelige og malign transformation 4-15,16. Virkningerne af vækst i nærvær af ekstracellulært matrixmateriale, andre celletyper, og / eller 3D-kultur kan sammenlignes med vækst på plast 5,15. Cultured HMEC, startende med normale celler, give et eksperimentelt medgørlig-system til at undersøge faktorer, derkan fremdrive eller forhindre menneskers aldring og carcinogenese.
Den humane brystvæv forarbejdningsmetode præsenteres her muliggør opnåelse af rene mammae epitelceller fra den heterogene blanding af celletyper i det humane bryst. Filtrering gennem porer med fast størrelse tillader adskillelse af forskellige fraktioner af mælkekirtlen (f.eks ductal og ductal-alveolar vs alveolar) fra det fordøjede stromal matrix. Isogene mamma fibroblaster kan fås til at matche epitelcellerne. Frozen fordøjet materiale har bevaret god rentabilitet i over 30 år. Denne metode har fungeret succesfuldt på alle men meget fibrøse mammae væv, og er enkel at udføre. Andre variationer af brystvæv behandling findes, der ikke giver epiteliale fraktioner, der er så levedygtige, ren eller separeret. Placering af forarbejdede organoids i kultur med lave stress-fremkaldende medier, såsom M87A tillader langsigtet vækst i HMEC med flere afstamning markører. HMEC som er blevet dyrket på plast stadig bevarer evnen til at slægterte 3D strukturer med normal in vivo-lignende afstamningsceller relationer. Disse HMEC kulturer er velegnede til omfattende eksperimentel undersøgelse, herunder high throughput, af normal HMEC adfærd og faktorer, der kan fremdrive eller hæmme ældning og transformation.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, og MRS støttes af NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og Laboratory Directed Forskning og Udvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |