En metode for å behandle humant mammary kirurgisk forkast materiale er beskrevet. Behandlet vev, i form av organoids, kan lagres frosset uendelige eller plassert i kultur for langsiktig vekst. Denne metoden muliggjør eksperimentelle undersøkelse av normal human epitelisk cellebiologi, og virkningene av eksogene perturbasjoner.
Eksperimentell undersøkelse av normal menneskelig mammary epitelceller (HMEC) adferd, og hvordan normale celler skaffe unormale egenskaper, kan lettes ved in vitro kultur systemer som mer nøyaktig modell in vivo biologi. Bruken av menneskelige avledet materiale for å studere cellulær differensiering, er aldring, senescence, og immortalization spesielt fordelaktig gitt mange viktige molekylære forskjeller i disse egenskapene mellom menneskelige og vanligvis benyttes gnagere celler 1-2. Mammary celler presentere en praktisk modell system fordi store mengder normale og unormale vev er tilgjengelig på grunn av hyppigheten av reduksjon mammoplasty og mastektomi kirurgi.
Melkekjertlene består av en kompleks blanding av mange forskjellige celletyper, f.eks epiteliale, adipose, mesenchymale, endotelialceller. Epitelceller er ansvarlig for differensiert mammary funksjon av amming,og er også opphavet til det store flertallet av mennesker brystkreft. Vi har utviklet metoder for å behandle brystkjerteltumorer kirurgiske forkaste vev til ren epiteliale komponenter samt mesenchymalceller 3. Den prosesserte materialet kan lagres frosset på ubestemt tid, eller initiert i primær kultur. Kirurgisk Forkast materiale transporteres til laboratoriet og manuelt dissekerte å berike for epitelisk inneholdende vev. Etterfølgende fordøyelse av den dissekerte vev ved hjelp kollagenase og hyaluronidase strimler stromal stoff fra epitel ved basalmembran. De resulterende små stykker av epiteliale treet (organoids) kan atskilles fra fordøyd stroma ved sekvensiell filtrering på membraner av fast porestørrelse. Avhengig porestørrelse, kan fraksjoner oppnås bestående av større duktale / alveolar stykker, mindre alveolære klynger, eller stromal celler. Vi har observert overlegen vekst når kulturer er initiert som organoids enn som distilknyttede enkeltceller. Plassering av organoids i kultur ved hjelp av lav-stress inducing media støtter langsiktig vekst av normal HMEC med markører for flere avstamning typer (myoepithelial, luminal, stamfar) 4-5. Tilstrekkelig antall celler kan fås fra en individets vev for å tillate utstrakt eksperimentell undersøkelse ved standardiserte celle batcher samt spørresignaler bruker høye gjennomstrømning modaliteter.
Cultured HMEC har vært beskjeftiget i en rekke studier som undersøkte normale prosesser som styrer vekst, differensiering, aldring og senescence, og hvordan disse vanlige prosesser blir endret under udødelig og malign transformasjon 4-15,16. Effektene av vekst i nærvær av ekstracellulært matriksmateriale, andre celletyper, og / eller 3D kulturen kan sammenlignes med veksten på plast 5,15. Helstøpt HMEC, starter med normale celler, gi en eksperimentelt medgjørlig system for å undersøke faktorer somkan drive eller hindre menneskelig aldring og kreftutvikling.
Den menneskelige mammary vev prosesseringsmetode presenteres her muliggjør innhenting rene mammary epitelceller fra den heterogene blanding av celletyper i det menneskelige bryst. Filtrering gjennom porer fast størrelse tillater separasjon av forskjellige fraksjoner av melkekjertlene (f.eks ductal og ductal-alveolære vs alveolar) fra fordøyd stromal matriks. Isogene mammary fibroblaster kan fås å matche epitelceller. Frossen fordøyd materiale har beholdt god levedyktighet i over 30 år. Denne metoden har fungert hell på alle, men veldig fibrøse mammary vev, og er enkel å utføre. Andre varianter av mammary vev behandling eksisterer som ikke gir epiteliale fraksjoner som er like levedyktig, ren eller separert. Plassering av bearbeidede organoids i kultur med lave stress-induserende medier som M87A lar langsiktig vekst av HMEC med flere avstamning markører. HMEC som har blitt dyrket på plast fortsatt beholde muligheten til å generate 3D strukturer med normal in vivo-lignende avstamning relasjoner. Disse HMEC kulturer er egnet for omfattende eksperimentell undersøkelse, inkludert høy gjennomstrømning, med normal HMEC atferd og faktorer som kan drive eller hemme senescence og transformasjon.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, og MRS er støttet av NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og ved Laboratory rettet forskning og utvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |