Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.
Experimenteel onderzoek van normale menselijke mammaire epitheelcellen (HMEC) beïnvloed en normale cellen verkrijgen abnormale eigenschappen kan worden vergemakkelijkt door in vitro kweeksystemen die beter model in vivo biologie. Het gebruik van mensen afgeleide materiaal voor onderzoek cellulaire differentiatie, veroudering, veroudering en immortalisatie is bijzonder voordelig gezien de vele belangrijke moleculaire verschillen in deze eigenschappen tussen mens en gewoonlijk gebruikt knaagdiercellen 1-2. Mammaire cellen aanwezig gunstig modelsysteem omdat grote hoeveelheden normale en afwijkende weefsels zijn gezien de frequentie van vermindering mammoplasty en mastectomie operaties.
De melkklier bestaat uit een complex mengsel van vele verschillende celtypes, bijvoorbeeld epitheliale, adipose, mesenchymale, endotheliale. De epitheliale cellen zijn verantwoordelijk voor de gedifferentieerde functie borst van lactatieen ook de oorsprong van de overgrote meerderheid van de borstkankers. Wij hebben methoden ontwikkeld om borstklier chirurgische aflegstapel weefsels verwerken tot pure epitheliale componenten en mesenchymale cellen 3. Het verwerkte materiaal kan worden opgeslagen onbeperkt bevroren of gestart in primaire cultuur. Chirurgische discard materiaal naar het laboratorium en handmatig ontleed te verrijken voor epitheliale bevattend weefsel. Daaropvolgende digestie van het ontleed weefsel met collagenase en hyaluronidase strips stromale materiaal van het epitheel in het basale membraan. De verkregen stukjes van de epitheliale boom (organoids) kan worden gescheiden van de gedigereerde stroma door opeenvolgende filtratie op membranen van vaste poriegrootte. Afhankelijk poriegrootte kan fracties daarvan bestaande uit grotere ductale / alveolaire stukken kleiner alveolaire clusters of stromacellen. We hebben gezien superieure groei wanneer culturen worden geïnitieerd als organoids in plaats van als disassocieerd enkele cellen. Plaatsing van organoids in cultuur met behulp van lage-stress inducerende media ondersteunt groei op lange termijn van de normale HMEC met markers van meerdere afstamming types (myo, luminale, stamvader) 4-5. Voldoende aantallen cellen worden verkregen uit weefsel van een individu om uitgebreid experimenteel onderzoek met gestandaardiseerde cel batches, alsmede uitlezing met high throughput wijze mogelijk.
Gekweekte HMEC zijn gebruikt in een breed scala van studies naar de normale processen die groei, differentiatie, veroudering, en senescentie, en hoe deze normale processen worden gewijzigd tijdens onsterfelijk en maligne transformatie 4-15,16. De effecten van groei in de aanwezigheid van extracellulaire matrix materiaal, andere celtypes en / of 3D cultuur kan worden vergeleken met groei op plastic 5,15. Gekweekte HMEC, beginnend met normale cellen, geven een experimenteel systeem tractable factoren onderzochtkunnen voortbewegen of voorkomen van menselijke veroudering en het ontstaan van kanker.
Het menselijk borstweefsel verwerkingsmethode gepresenteerde kunnen verkrijgen van zuivere mammaire epitheelcellen van het heterogene mengsel van celtypen in de menselijke borst. Filtratie door poriën met een vaste grootte kan scheiding van verschillende delen van de borstklier (bijv. ductaal en ductale-alveolaire versus alveolaire) uit het verteerde stromale matrix. Isogene borstklieren fibroblasten kan worden verkregen aan de epitheelcellen te passen. Bevroren verteerd materiaal heeft behouden een goede levensvatbaarheid meer dan 30 jaar. Deze methode is succesvol gewerkt maar alle zeer vezelig borstweefsels en is eenvoudig uit te voeren. Andere variaties van borstweefsel verwerking bestaan die niet epitheliale fracties die als levensvatbaar, schoon, of gescheiden te bieden. Plaatsing van verwerkte organoids in cultuur met een lage stress-inducerende media zoals M87A staat lange-termijn groei van HMEC met meerdere afstamming markers. HMEC die zijn gekweekt op plastic nog steeds de mogelijkheid generate 3D structuren met normale in vivo-achtige lineage relaties. Deze HMEC culturen zijn geschikt voor extensieve experimenteel onderzoek, met inbegrip van high throughput, van normaal HMEC gedrag en factoren die kunnen voortbewegen of remmen veroudering en transformatie.
The authors have nothing to disclose.
MAL, GAG, en MRS worden ondersteund door de NIA (R00AG033176 en R01AG040081) en door Laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |