Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.
Exame experimental de comportamento epitelial humana normal das células mamárias (HMEC), e como normal, as células adquirem propriedades anormais, pode ser facilitada por sistemas de cultura in vitro, que maior precisão do modelo em biologia vivo. A utilização de material derivado humano para estudar a diferenciação celular, envelhecimento, senescência, e imortalização é particularmente vantajosa tendo em conta as muitas diferenças significativas moleculares nestas propriedades entre as células humanas e de roedores comumente utilizado 1-2. Células mamárias apresentam um sistema modelo conveniente, porque grandes quantidades de tecidos normais e anormais estão disponíveis devido à freqüência da mamoplastia redutora e cirurgias de mastectomia.
A glândula mamária consiste de uma mistura complexa de muitos tipos de células diferentes, por exemplo, tecido adiposo, epitelial, mesenquimal, endoteliais. As células epiteliais são responsáveis pela função diferenciada mamária de lactação,e são também a origem da grande maioria dos cancros da mama humanos. Nós desenvolvemos métodos para processar tecidos de glândula mamária de descarte cirúrgicos em puros componentes epiteliais, bem como células mesenquimais 3. O material processado pode ser armazenado congelado indefinidamente, ou iniciados em cultura primária. O material de descarte cirúrgico é transportado para o laboratório e manualmente dissecado para enriquecer para o tecido epitelial contendo. Digestão posterior do tecido dissecado usando colagenase e hialuronidase tiras de material a partir do epitélio do estroma na membrana basal. Os pedaços resultantes pequenas da árvore epitelial (Organóides) pode ser separado a partir do estroma digerido por filtração sequencial sobre membranas de dimensão de poro fixa. Dependendo do tamanho do poro, podem ser obtidas fracções consistindo em maiores ductais / alveolar peças, aglomerados menores alveolar, ou células do estroma. Temos observado crescimento superior quando as culturas são iniciadas como Organóides em vez de dissociada células individuais. Colocação de Organóides na cultura usando a mídia de baixo estresse indutores suporta crescimento de longo prazo de HMEC normal com marcadores de linhagem tipos múltiplos (mioepiteliais, progenitor, luminal) 4-5. Um número suficiente de células podem ser obtidas a partir de tecido de um indivíduo para permitir o exame experimental extenso usando lotes de células padronizados, bem como o uso de interrogação modalidades de elevada capacidade.
HMEC cultivadas têm sido empregues numa vasta variedade de estudos que examinam os processos normais que regulam o crescimento, diferenciação, o envelhecimento, e senescência, e como estes processos normais são alteradas durante a transformação maligna e imortal 4-15,16. Os efeitos do crescimento na presença de material de matriz extracelular, outros tipos de células, e / ou a cultura em 3D pode ser comparado com o crescimento em 5,15 plástico. HMEC cultivadas, a partir de células normais, fornecer um sistema experimental para examinar os factores tratável quepode impulsionar ou prevenir o envelhecimento humano e carcinogênese.
O método de processamento de tecido mamário humano aqui apresentada permite a obtenção de células epiteliais mamárias puros da mistura heterogénea de tipos de células no coração humano. A filtração através de poros de tamanho fixo, permite a separação de diferentes fracções de glândula mamária (por exemplo, ductal e ductal-alveolar vs alveolar) a partir da matriz estromal digerido. Isogénicas fibroblastos mamarias podem ser obtidas para coincidir com as células epiteliais. Material digerido congelado manteve viabilidade bom por mais de 30 anos. Este método tem trabalhado com sucesso em todos os mas muito fibrosos tecidos mamários, e é simples de executar. Outras variações de processamento de tecido mamário que existem não fornecem fracções epiteliais que são tão viáveis, limpo, ou separados. Colocação de Organóides processados em cultura com baixas indutoras de stress mídia, como M87A permite crescimento de longo prazo de HMEC com marcadores de linhagem múltiplos. HMEC que foram cultivadas em plástico ainda mantêm a capacidade de géneroste estruturas 3D com normal em relacionamentos vivo-como linhagem. Estas culturas HMEC são adequados para investigação experimental extenso, incluindo produção elevada, de comportamento normal e HMEC fatores que podem impulsionar ou inibir a senescência e transformação.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, e MRS são suportados pela NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e pelo Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Directed, EUA Departamento de contrato de Energia # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |