En metod att bearbeta humant bröst kirurgiskt kasserat material beskrivs. Bearbetade vävnader, i form av organoids kan frysas på obestämd tid eller placeras i kultur för långsiktig tillväxt. Denna metod möjliggör experimentell undersökning av normal mänsklig epitelceller biologi och effekterna av exogena störningar.
Experimentell undersökning av normal mänsklig bröst epitelcell (HMEC) beteende och hur normala celler förvärvar abnorma egenskaper, kan underlättas genom in vitro odlingssystem som mer exakt modell in vivo biologi. Användningen av mänskliga härrör material för att studera cellulär differentiering är åldrande, åldrande och immortalisering särskilt fördelaktigt med tanke på de många viktiga molekylära skillnader i dessa egenskaper mellan människor och allmänt utnyttjad gnagarceller 1-2. Mammarceller utgör ett bekvämt modellsystem då stora mängder av normala och onormala vävnader finns tillgängliga på grund av frekvensen av reduktion mammoplasty och operationer mastektomi.
Bröstkörteln består av en komplex blandning av många olika celltyper, t.ex., epitelial, adipos, mesenkymal, endotel. Epitelcellerna är ansvariga för differentierade bröst funktion amning,och är också ursprunget till den stora majoriteten av humana bröstcancrar. Vi har utvecklat metoder för att behandla bröstkörteltumörer kirurgiska fångst som kastas överbord vävnader till rena epiteliala komponenter samt mesenkymala celler 3. Det bearbetade materialet kan förvaras frysta på obestämd tid, eller invigd i primär kultur. Kirurgisk kasserat material transporteras till laboratoriet och manuellt dissekerades för att anrika epitelial innehållande vävnad. Efterföljande digestion av den dissekerade vävnaden med kollagenas och hyaluronidas remsor stromalt material från epitelet vid basalmembranet. De resulterande små bitar av den epiteliala trädet (organoids) kan separeras från den digererade stroma genom sekventiell filtrering på membran av fast porstorlek. Beroende på porstorleken, kan fraktioner erhållas bestående av större duktala / alveolära bitar, mindre kluster alveolära eller stromaceller. Vi har observerat överlägsen tillväxt när kulturer initieras som organoids snarare än som disintressebolag enstaka celler. Placering av organoids i kultur med låg-stress inducerande media stödjer den långsiktiga tillväxten av normal HMEC med markörer för MLK typer (myoepithelial, luminala, stamfader) 4-5. Tillräckligt antal celler kan erhållas från en individs vävnad för att omfattande experimentell undersökning med standardiserade cell partier samt förhör med hög kapacitet modaliteter.
Odlade HMEC har använts i ett stort antal studier undersökt de normala processer som styr tillväxt, differentiering, åldrande och åldrande, och hur dessa normala processer förändras under odödlig och malign transformation 4-15,16. Effekterna av tillväxt i närvaro av extracellulär matrix material, andra celltyper, och / eller 3D kulturen kan jämföras med en tillväxt på plast 5,15. Odlade HMEC, som börjar med normala celler, ger en experimentellt lätthanterlig för att undersöka faktorer somkan driva eller förhindra människans åldrande och cancer.
Den humana mammarvävnad bearbetningsmetod presenteras här möjliggör erhållande av ren mammära epitelceller från den heterogena blandningen av celltyper i den mänskliga bröst. Filtrering genom porer av fast storlek tillåter separation av olika fraktioner av bröstkörteln (t.ex. duktal och duktal-alveolära vs alveolära) från den spjälkade stromal matrisen. Isogena mammary fibroblaster kan erhållas för att matcha de epiteliala cellerna. Fryst ned materialet har behållit god lönsamhet i över 30 år. Denna metod har fungerat framgångsrikt på alla men mycket fibrösa bröst vävnader, och är enkel att utföra. Andra varianter av bröstvävnad bearbetning som varken ger epiteliala fraktioner som är så livskraftig, ren eller separerade. Placering av bearbetade organoids i kultur med låga stress-inducerande media såsom M87A tillåter långsiktig tillväxt av HMEC med MLK markörer. HMEC som har odlats på plast fortfarande kvar möjligheten att släktente 3D strukturer med normal in vivo-liknande härstamning relationer. Dessa HMEC kulturer är lämpliga för omfattande experimentell undersökning, inklusive hög genomströmning, normal HMEC beteende och faktorer som kan driver eller hämma åldrande och transformation.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG och MRS stöds av NIA (R00AG033176 och R01AG040081) och Laboratory inriktad forskning och utveckling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |