Påvisning av Protein palmitoylation i Cultured hippocampus neurons ved Immunoutfellingsanalyse og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Summary

Den reversible tilsetning av palmitate til proteiner er en viktig regulator av intracellulær protein menneskehandel. Dette er av spesiell interesse i nevroner hvor mange synaptiske proteiner palmitoylated. Vi benytter en enkel biokjemisk metode for å detektere palmitoylated proteiner i dyrkede nevroner, som kan tilpasses for flere celletyper og vev.

Abstract

Palmitoylation er en post-translasjonell modifikasjon lipid involverer festing av en 16-karbon mettet fettsyre, palmitat, til cysteinrester av substrat proteiner gjennom en labil thioester obligasjon [gjennomgått i ^en]. Palmitoylation av et substrat protein øker dens hydrofobisitet, og vanligvis letter dens menneskehandel mot cellulære membraner. Nyere studier har vist palmitoylation å være en av de vanligste lipid endringer i ^{en nevroner, 2,} noe som tyder på at palmitat omsetning er en viktig mekanisme for disse cellene regulerer målretting og trafficking av proteiner. Identifisering og gjenkjenning av palmitoylated underlag kan derfor bedre vår forståelse av protein trafficking i nerveceller.

Påvisning av protein palmitoylation i fortiden har vært teknisk hindret grunnet mangel på en konsensus sekvens blant substrat proteiner, og avhengigheten metabolske labeling av palmitoyl-proteiner med ³ H-palmitat, en tidkrevende biokjemisk analysen med lav følsomhet. Utvikling av Acyl-Biotin Exchange (ABE) analysemedium muliggjør raskere og høy følsomhet påvisning av palmitoylated proteiner ^2-4, og er optimal for å måle det dynamiske omsetning palmitate på neuronmembraner proteiner. ABE-analysen består av tre biokjemiske trinn (figur 1): 1) irreversible blokade av umodifiserte cystein tiolgrupper bruker N-ethylmaliemide (NEM), 2) spesifikke spalting og avslørt av palmitoylated cystein er tiolgruppe av hydroksylamin (HAM), og 3) selektiv merking av palmitoylated cystein ved hjelp av en tiol-reaktiv biotinylation reagens, biotin-BMCC. Rensing av tiol-biotinylerte proteiner etter de ABE trinnene har forskjellig, avhengig av den generelle formålet med forsøket.

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å rense en palmitoylated protein av interesse i primær hippocampal nevroner etter en innledende immunoutfelling (IP) trinn med et antistoff rettet mot proteinet, etterfulgt av ABE analysen og Western blotting å direkte måle palmitoylation nivåer av at protein, som er betegnet IP-ABE analysen. Low-density kulturer av embryonale rotte hippocampus nevroner har vært mye brukt for å studere lokalisering, funksjon og trafficking av nevrale proteiner, noe som gjør dem ideelt egnet for å studere neuronal protein palmitoylation bruker IP-ABE analysen. IP-ABE analysen krever hovedsakelig standard IP og vestlige blotting reagenser, og er kun begrenset av tilgangen på antistoffer mot målet underlaget. Denne analysen kan lett tilpasses for rensing og detektering av transfekterte palmitoylated proteiner i heterologe cellekulturer, primære nevronale kulturer avledet fra ulike hjernen vev av både mus og rotter, og selv primær hjernevev selv.

Protocol

1. Utvinning av Target Protein fra Cultured Primary hippocampus Neurons

1. Før høsting endogent protein fra primære hippocampus celler, utarbeide en Lysis Buffer (LB, Tabell 1) med proteasehemmere. Til 10 ml av lysebuffer, tilsett 0,1 ml phenylmethanesulfonyl fluorid oppløsning (PMSF) til en endelig konsentrasjon av 10 mM, og tilsett 1 protease inhibitor cocktail tablet.
2. Forbered N-etylmaleimid (NEM) løsning (tabell 1) fra frysetørket pulver. Forsiktig oppløses i 100% EtOH ved romtemperatur (RT). Alltid forberede NEM løsning frisk for dagen av eksperimentet.
3. Neste kombinere lyseringsbuffer og NEM. Tilsett 0,5 ml av 2M NEM løsning til en frisk 50 ml konisk rør. Tilsett 20 ml LB over toppen, og raskt sted LB + NEM (sluttkonsentrasjon av 50 mM) på en gyngende plattform ved 4 ° C til fullt blande i 5 minutter. Alltid legge NEM / EtOH løsning første og LB andre, slik som å skikkelig blander disse to.
4. Fjern kulturperler neurons fra inkubator og legg på is *. Forsiktig fjerne cellulære medier, og forsiktig vask to ganger med kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS) 1x. Legge 300 ml LB + 50 mM NEM til den første brønnen av hippocampus nevroner, og skrape celler ved hjelp av en disponibel celle løfteren. Samle cellelysat, deretter tømmes lysatet inn neste brønn av den gruppen. Skrap celler i den andre brønnen ved hjelp av cellen løfteren, samle, og gjenta med en tredje brønn, hvis det er nødvendig for å ytterligere konsentrere lysatet.
5. Utlevering cellelysat inn i en pre-avkjølt (på is), 1,5 ml mikrosentrifuge-rør. Gjenta trinn 1,4 med 100 pl LB + 50 mM NEM å samle eventuelle gjenværende cellelysat. Pass total cellelysat gjennom en 26 ½ måle sprøyte 5-6 ganger for å hjelpe i mekanisk lysis, er forsiktig med å ikke blåse bobler i løsningen. Man kan i stedet sonicate i 15 sekunder på isen, hvis utstyret er tilgjengelig. Nutate cellelysat for ≥ 30 min ved 4 ° C.
6. Avklare cellen LysaTe ved sentrifugering ved 16.000 xg / 30 min, for å un-pellet lyserte celler og vaskemiddel-uløselig materiale.
7. Samle ryddet cellelysat (supernatant) i en ny på forhånd avkjølt 1,5 ml rør på is. Gjenta høste protokoll for alle grupper av celler. Mål proteinkonsentrasjon i alle prøver ved å bruke BCA lysatet assay og normalisere volumet av alle lysatet prøver fra grupper av celler til å ha nøyaktig lik total protein, med en anbefalt minimum 500 ug. Fyll opp alle prøver med LB + 50 mM NEM til 500 ul totalvolum.
8. Legg 1-5 ug av primær antistoff rettet mot målproteinet til hver av lysat prøve. Nutate de antistoff-lysat blandingskulturer natten ved 4 ° C.

* Primær rotte hippocampus nevroner bør dyrket ved en tetthet på ca 250.000 celler / brønn i en 6-brønn parabol, i et serum-fritt medium som inneholder et B27 neuronal supplement, som tidligere beskrevet ^5, og dyrket for det ønsked tidsrom, typisk 14-16 dager in vitro (DIV) for å oppnå modenhet. Et minimum av 500 ug totalt protein anbefales å vellykket immunoutfelte og biotinylate en target neuronal protein, som typisk krever 2-3 brønner på et 6-brønn parabolen.

2. Utfelling av antistoff-bundet målprotein

1. Før utfelling og immobilisering et målprotein, forberede en 50% oppslemming av protein A, eller protein G-Sepharose-kuler belagt. Spesielt legger ≥ 60 ul Sepharose perler per sampling til 1,5 ml rør, slik at alle prøvene har like mengder av perler. Magnetiske perler er også egnet hvis utstyret er tilgjengelig.
2. Legg et likt volum på 50% oppslemming til hver antistoff-lysat prøven, og for nutate ≥ 1 time ved 4 ° C.

3. Acyl-Biotin Exchange: Hydroksylamin (HAM) Cleavage

1. Mens utfører trinn 2,2, forberede et antall rør med lyseringsbuffer (LB) different pH-verdier. PH er svært viktig for disse trinnene, og bør alltid justeres ved hjelp av en pH-meter. Forbered 2 ml LB pH 7,2 per prøve, og 0,5 ml av Streng Buffer per prøve (Tabell 1). Også forberede 0,5 ml LB + 10 mM NEM per prøve, som i trinn 1.1 til 1.3. Legg PMSF og proteasehemmer tabletter til alle lysis buffere, som i trinn 1.1.
2. 1. Hydroksylamin (HAM) er et kraftig reduksjonsmiddel, hvis spalting av palmitat fra cysteinene kreves for biotinylation (figur 1), og utelatelsen av HAM cleavage tjener som en negativ kontroll. Splitte hver prøve av perler i to prøver, en utelate HAM cleavage trinn (-HAM), og en inkludert HAM trinn (+ HAM). Normalisere for proteinnedbrytning skyldes HAM behandling, bør en splitte hver prøve til tredjedeler, med 1/3 av de perler som brukes for-HAM kontrollen, og de resterende 2/3 benyttet for + HAM behandling.
   2. Forbered ytterligere en.5 ml rør på is, merket som-HAM kontrollen for hver prøve. Etter trinn 2.2, forsiktig sentrifuger alle prøver 'perler på 0,5 xg / 1 min ved 4 ° C (sentrifuger ved denne hastigheten, varighet og temperatur for alle gjenværende trinnene med mindre annet er oppgitt), plasserer rørene på is, fjern supernatanten, og resuspendere perlene i 600 ul LB + 10 mM NEM.
3. Etter re-suspendering av prøvene 'perler i lyseringsbuffer + NEM 10 mM, umiddelbar innsamling 200 ul av prøven i lysatet-bead oppslemning, og utslipp i den prøven er-HAM rør på isen. Legge til en ekstra 300 pl LB + 10 mM NEM til-HAM prøven, og en ytterligere 100 ul til + HAM prøven for totalt 500 pl i hver prøve. Inkuber rørene i 10 minutter på is.
4. Resuspendere (vaske) the-HAM og + HAM prøver forsiktig med 0,5 ml strenge buffer, per prøve. Utføre dette trinnet raskt, som en lengre SDS inkubering vil resultere i fjerning av bundet antistoff fraperler.
5. Vask forsiktig alle prøvene tre ganger i 0,5 ml / prøve av LB pH 7,2, og spinne ned mellom hver vask som i trinn 3.2b.
6. Mens du utfører trinn 3.5, utarbeide en HAM buffer (tabell 1). Legg passende volum av hydroksylamin-løsning til et nytt rør, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1M i et volum på 0,5 ml LB pH 7,2, pr + HAM prøve. Alltid forberede HAM buffer frisk for dagen av eksperimentet. Tilsett 0,5 ml / prøve av LB pH 7,2 til all-HAM prøver, og 0,5 ml / prøve av HAM buffer til alle + HAM prøver.
7. Nutate alle prøvene i 1 time ved romtemperatur (RT). Ikke overskrid 1 time.

4. Acyl-Biotin Exchange: Biotin-BMCC Merking

1. Mens utfører trinn 3,6, forberede 2 ml LB pH 6,2 per prøve (tabell 1), som i trinn 3.1. Plasser LB pH 6,2 på is inntil nødvendig. Også forberede en stamløsning av Biotin-BMCC (Tabell 1) umiddelbart før bruk. Vei opp exactly 2,1 mg biotin-BMCC, samle seg i et 1,5 ml rør og forsiktig oppløse i 0,5 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) ved å plassere på en vuggende plattform ved RT, for å oppnå 8MM konsentrasjon (ikke bruk en pipette for å bryte opp pulveret ).
2. Når trinn 3.6 er fullført, forsiktig vaske perlene gang i pH 6,2 lyseringsbuffer, for å fjerne gjenværende HAM buffer. Supernatanten fjernes, og plassere prøvene på is.
3. Biotin-BMCC er maliemide konjugert biotin molekyl som har en høy affinitet for frie tiolgrupper av cysteinene (figur 1). Mens utfører trinn 4,2, forberede 0,5 ml Biotin-BMCC Buffer (Tabell 1) per prøve, på arbeids konsentrasjon mellom 0,5 uM til 5 uM. Konsentrasjoner av 5 pM vil trolig mette målproteinet ^6, og vanligvis bør ikke overskrides, men dette kan variere avhengig av den ønskede målproteinet. Tilsett 0,5 ml av Biotin-BMCC buffer til hver prøve, og nutate for nøyaktig 1 time ved 4 &grader; C. Ikke overskrid 1 time.

5. Eluering av biotin-konjugert målprotein og SDS-PAGE

1. Når trinn 4.3 er ferdig, forsiktig vaske alle prøvene en gang i LB pH 6,2. Hold alle prøvene på is i mellom hver vask. Fjern 2x SDS prøvebuffer uten reduksjonsmidler (Tabell 1) fra -20 ° C lagring og langsomt tine på isen.
2. Vask forsiktig prøver tre ganger i LB pH 7,5 + PMSF / hemmere, og holde prøvene på is i mellom hver vask.
3. Supernatanten fjernes fra den tredje vask, forlater pelleterte kuler i en slurry med gjenværende buffer i bunnen av røret. Dypp en pipette med en liten-diameter spiss (en gel lasting spissen eller P2 pipettespiss er tilstrekkelig) inn i selve bunnen av røret gjennom oppslemmingen, og raskt samle eventuelle gjenværende buffer, være forsiktig for ikke å ta opp eventuelle perler.
4. Supplere 2x SDS prøvebuffer med DL-Dithiothreitol (DTT) for å oppnå en endelig konsentrasjon av 5mM. Legg40-50 ul 2x prøvebuffer + 5mM DTT til hver prøve. Om nødvendig, vortex perlene for å blande med prøvebuffer, og umiddelbart sentrifuge ved høy hastighet for å samle alle perler i en pellet, nedsenket i prøvebuffer.
5. Kok alle prøvene i 10 minutter ved 75-80 ° C. La prøvene kule til RT for ≥ 10 min på benken toppen, og sentrifuger ved 16000 xg / 3 min til helt pellet perlene.
6. Legg komplett volum eluerte protein (supernatant) fra hver prøve til en enkelt lane innenfor en polyakrylamidgel egnet for Western blotting ved å bruke SDS-PAGE ^7. Organisere alle prøvene, slik at-HAM kontroll eluent og + HAM elueringsmiddel for en enkelt prøve er kjøres umiddelbart tilstøtende til hverandre i løpet av SDS-PAGE (figur 2). Etter SDS-PAGE, overføre til en PVDF eller nitrocellulosemembran.

6. Western Blotting og Påvisning av palmitoylation av Target Protein

1. Når trinn 5,6 er fullført, vaskes membranento ganger i Tris-bufret saltvann (TBS 1x) i 10 min på en gyngende plattform ved RT.
2. Forbered et Blokkering Buffer å blokkere ikke-spesifikk merking ved veiing ut Bovine Serum Albumin (BSA), for å oppnå 3% vekt i et volum av TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) som er tilstrekkelig til fullt senk membranen . For streptavidin blotting, alltid blokkere med BSA og ikke pulverisert melk. Blokker membranen i 1 time ved RT på en gyngende plattform.
3. Forbered et antistoff oppløsning av TBS-T + 0,3% BSA. Legg Streptavidin-HRP antistoff rekonstituert ved 1 mg / ml i destillert vann, fortynnet til 1:5,000-1:10,000. Når trinn 6,2 er fullført, vaskes membranen gang i TBS-T i 10 min, deretter inkuberes membranen i Streptavidin antistoff løsning på en vuggende plattform for enten i 1 time ved RT, eller over natten ved 4 ° C.
4. Vask membranen tre ganger i TBS-T i 10 min på en gyngende plattform. For å oppdage palmitoylation signal, utsett HRP luminescence med en chemiluminescent underlaget kit.
5. For å normalisere palmitoylation nivåer til mengden av protein av interesse som ble immunoutfelt, strip membranen ved hjelp av Western blot stripping buffer i 5-10 min på en gyngende plattform ved RT. Gjenta trinn 6,1 til 6,4 ved hjelp av den primære antistoff mot protein av interesse som opprinnelig ble brukt for immunoutfelling.
6. Kvantifisere palmitoylation av protein av interesse ved bildeanalyse programvare, og normalisere palmitoylation nivåer til mengden av immunoutfelt protein.

Representative Results

IP-ABE analysen oppdager spesifikt tiol-palmitoylation av cysteinrester langs substrat proteiner, og kan brukes til å oppdage palmitoylation av immunoutfelt neuronale proteiner på en måte vist i fig 1. Behandling av immunoutfelt nevronal protein med HAM (figur 1) kløyver thioester kobling mellom palmitat og et cystein er tiolgruppe, slik at for bestemte inkorporering av biotin-BMCC på nylig tilgjengelig tiolgruppe, som kan deretter påvises ved hjelp av Western blotting. Utelatelsen av HAM (minus-HAM) cleavage hindrer inkorporering av biotin-BMCC og fungerer som en negativ kontroll for konkret palmitoyl-biotinylation på pluss-HAM prøve, og bør derfor alltid kjøres ved siden av pluss-HAM prøve for vestlige blotting ved SDS-PAGE (figur 2).

I en optimalisert eksperiment (figur 2a), palmitoylationsignalet i neuronal proteinekstravasasjon δ-catenin ² lett kan detekteres av blotting for biotin-BMCC ved en konsentrasjon på 1 uM, hjelp streptavidin konjugert med HRP, mot parallelle minus-og pluss-HAM prøver. Den spesifikke palmitoylation signal for δ-catenin vises på sitt spådd størrelse på 160kD, bare i pluss-HAM prøve. Spesifisiteten av dette signalet ble bekreftet ved reprobing for δ-catenin med det spesifikke antistoff som ble brukt til immunoutfelte det, noe som resulterer i et signal i begge HAM behandlinger på samme spådd størrelse. Optimalisering av den IP-ABE analysen (figur 2A), vil resultere i en Western blot-profil av en minus-HAM undersøkelsen som lett kan skilles fra pluss-HAM prøve, og oppviser minimal til ingen palmitoylation signal.

Konsentrasjonen av biotin-BMCC brukes til å merke palmitoylated cysteinene krever nøye optimalisering, og hvis en super-saturating konsentrasjon av biotin-BMCC brukes under ABE kjemi trinn (figur 2B), overdreven bakgrunn og uspesifikke signaler vil være synlig. En lineær respons kurve for biotinylation et palmitoylated neuronal protein, α7 nikotinsyre acetylkolin reseptor, ved hjelp av biotin-BMCC har tidligere blitt bestemt ^6, og viser nær komplett metning ved en konsentrasjon på 5-10 pM. Selv om den optimale konsentrasjonen av biotin-BMCC avviker litt avhengig nevronale målproteinet, vil behandling med biotin-BMCC ved en konsentrasjon på over 5 uM sannsynlig super-mette målproteinet, og resultere i en Western blot Profilen med synlig bakgrunn og ikke-spesifikke signaler. En konsentrasjon av 0,5 uM for biotin-BMCC ble tidligere brukt til å påvise palmitoylation andre neuronale proteiner inkludert SNAP-25, huntingtin, AMPA reseptor subenheter GluA1 og GluA2 og paralemmin ^8, og bestemmelse av den optimale konsentrasjonen for en romanmålprotein kan oppnås ved prøving og feiling i lineært, starter i området 0,5 til 5 uM som vi beskriver her. De resulterende streptavidin vestlige blot profiler blant minus-og pluss-HAM prøver for δ-catenin palmitoylation ligne når de ble behandlet med 4 uM biotin-BMCC (figur 2B), med ytterligere bakgrunn signaler på forskjellige størrelser, noe som indikerer at upassende biotinylation skjedde.

Hydroksylamin er en kraftig reduksjonsmiddel som resulterer i begrenset nedbrytning av målproteinet i tillegg til sin effektiv spaltning av thioester kobling. Derfor krever optimalisering av ABE kjemi en å normalisere mengden immunoutfelt protein som brukes for minus-og pluss-HAM prøver (trinn 3.2 til 3.3). Normalisering krever bruk av doble av immobilisert målprotein i pluss-vs minus-HAM prøve, som faktisk resulterer i utvisket Western blotting profiler for målproteinet, som vist for δ-catenin (Figur 2A, B). Imidlertid, hvis mengden av immobilisert målprotein ikke er normalisert mellom minus-og pluss-HAM prøvene, kan den resulterende Western blot signal for målproteinet i pluss-HAM prøven gå tapt, som vist for δ-catenin når like mengder protein ble brukt i begge HAM behandlinger (figur 2C).

Spesifisiteten av ABE kjemi for merking palmitoylated proteiner er svært følsom og krever optimalisering. De vanlige fallgruvene oppstått under IP-ABE assay inkluderer sub-optimale resultater vist i figurene 2B og 2C, og nedbrytning av målproteinet, uavhengig av HAM behandling, som vanligvis forårsakes av eldre reagenser og buffere, og ukorrekt pH. For å unngå disse fallgruvene og korrigere for suboptimal ABE kjemi, friskhet og konsentrasjonen av de anvendte reagenser som kreves forbuffere oppført i tabell 1 bør alltid undersøkes, og pH justeringene av alle bufferne bør alltid kontrolleres før kjøringen av eksperimentet.

Buffer		Arbeidskonsentrasjon	Kommentarer
Lyseringsbuffer (LB)	I destillert H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH7.5 150 mM NaCl 10% Glyserol	N / A	Forbered før eksperimentet og oppbevar ved 4 ° C
NEM Solution	I 100% EtOH: NEM lyofilisert pulver	2 M	Forberede seg frisk, umiddelbart før bruk.
Streng Buffer	I LB: 10 mM MEM 0,1% SDS	N / A	Forbered kort tid før bruk, holde på is.
LB pH 7,2	I LB: Juster pH til nøyaktig 7,2	N / A	Bruk en pH-meter for å justere pH umiddelbart før bruk.
HAM Buffer	I LB pH 7,2: Stock HAM løsning	1 M (endelig HAM konsentrasjon)	Forbered umiddelbart før bruk.
LB pH 6,2	I LB: Juster pH til nøyaktig 6,2	N / A	Samme som for LB pH 7,2
Stock Biotin-BMCC Solution	I DMSO: 2,1 mg Biotin-BMCC løsning	8 mM	Forbered umiddelbart før bruk.
Biotin-BMCC Buffer	I LB pH 6.2: Legg Biotin-BMCC løsning	1-5 uM (avsluttende biotin-BMCC konsentrasjon)	Forbered umiddelbart før bruk.
2x SDS prøvebuffer, ingen reduksjonsmidler	I destillert H 2 O: 5% SDS 5% Glycerol 125mm Tris-HCL pH 6,8 0,01% Bromophenol Blå	N / A	Forbered før forsøket, og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk. Supplere med 5 mM DTT før bruk.

Tabell 1. Buffere og reagenser som er nødvendige for det IP-ABE analysen. Mange av lysis buffere kan fremstilles før begynnelsen av eksperimentet, men pH bør kontrolleres og justeres umiddelbart før bruk med et pH-meter, for å sikre suksess ABE kjemi. Flertallet av stamløsninger bør fremstilles frisk for hvert eksperiment, umiddelbart før bruk. Mange av buffere krever reagenser som er felles for de fleste laboratorier utstyrt for biokjemi, og spesialitet reagenser med leverandørinformasjon er oppført i tabellen over reagenser og utstyr.

Figur 1. Skjematisk av Immunoutfelling og acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) analysen å rense og oppdage palmitoylation av neuronmembraner proteiner. Cultured hippocampus nevroner lysert, (1) et målprotein blir deretter renset ved hjelp av en mål-spesifikt antistoff, og immobilisert på Sepharose perler belagt med protein G eller A. Den rensede målprotein er deretter (2) behandlet med N-ethylmaliemide (NEM) til irreversibelt binde og blokkere frie tiol (-SH) grupper langs ikkemodifiserte cysteinene (C). Målproteinet er deretter (3) underkastes behandling med hydroksylamin (HAM), som resulterer i spesifikk spalting av thioester obligasjoner til palmitoylated cysteinene og avsløring av en fri palmitoylated tiolgruppe (-SH). Neste, er målet protein (4) treated med en tiol-reaktiv biotin molekyl, biotin-BMCC, resulterer i spesifikk biotinylation for palmitoylated cystein. Endelig, (5) det biotinylerte målproteinet elueres og fjernet fra det antistoff-og vulsten. Målproteinet med sin palmitoylated cystein (er) tagget med biotin er nå egnet for SDS poly-akrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE), og Western blotting med streptavidin å oppdage for palmitoylation av renset neuronal proteinekstravasasjon. Klikk her for å vise større figur .

Figur 2. Påvisning av palmitoylation av neuronalt protein δ-catenin bruker IP-ABE-analysen. Primær rotte hippocampus nevronene ble dyrket som pretidligere har vært beskrevet ^5, ved en densitet på 130 celler / mm ² inntil modenhet ved 14DIV, ble deretter lysert, og underkastet IP-ABE analysen å påvise palmitoylation av en nylig identifisert palmitoylated neuronal substrat, δ-catenin ^2. Renset immunoutfellinger (IP) av δ-catenin (målprotein) ble isolert ved hjelp av 5 ug δ-catenin antistoff per prøve (BD transduksjon Laboratories), og ble deretter underkastet SDS-PAGE i parallell minus-og pluss-hydroksylamin (HAM) prøver. Palmitoylation ble detektert ved Western blotting (WB) med streptavidin-HRP (palmitoylation), og membranen ble strippet og underkastet en reprobe WB for δ-catenin. (A) En optimalisert representant IP-ABE resultat for palmitoylated δ-catenin (pilspiss) behandlet med 1 uM biotin-BMCC, illustrerer spesifisiteten av ABE kjemi for påvisning tiol-palmitoylated proteiner fra IP prøver. (B) En sub-optimal representanterrepresentativt IP-ABE resultat for δ-catenin, der et overskudd konsentrasjon av 4 uM biotin-BMCC ble brukt, som resulterer i ikke-spesifikke signaler og bakgrunn i både minus-og pluss-HAM prøver (piler). (C) Et annet suboptimal representant IP-ABE WB for δ-catenin, der en overdreven 4 pM konsentrasjon av biotin-BMCC ble brukt, og mengden av protein som brukes for pluss-HAM IP prøven ikke ble normalisert for HAM-mediert protein degradering, noe som resulterer i en tapt signal i reprobe WB for δ-catenin. Klikk her for å se større figur .

Discussion

IP-ABE assay presentert her er en enkel og svært sensitiv metode for å påvise palmitoylated proteiner i dyrkede primære hippocampus nevroner, bruker hovedsakelig standard biokjemiske teknikker. Dette gjør analysen lett tilpasses for laboratorier allerede utstyrt med Western blotting materialer. IP-ABE assay kombinerer en standard immunoutfelling protokoll til å isolere og immobilisere ens målprotein, etterfulgt av tidligere beskrevet ABE kjemi ^2-4 til raskt detektere nivåer av palmitat på et substrat protein. ABE teknikken har et bredt spekter av applikasjoner for behandlingen palmitoylated proteiner i forskjellige vev og cellelinjer, inkludert storskala palmitoyl-proteomikk screening av globale palmitoylation profiler, og rask påvisning av palmitoylation nivåer av en enkelt målproteinet.

Tidligere beskrivelser av ABE kjemi har utnyttet ulike metoder cellelyse og vaskemiddel utvinning av neuronal prot^{2 Eins, 9,} frie tiol-blokade ^{10, 11,} biotinylation, og rensing av målproteinet ^4, avhengig av applikasjonen av eksperimentet. Tilsetningen av palmitate til nevronale proteiner resulterer i deres målrettingen mot cellulære membraner, og påvisning av palmitoylated brøkdel av et målprotein vil kreve sin ekstraksjon fra disse membranene. Tidligere beskrevne ABE metoder har brukt en rekke ionisk ⁹ og ikke-ioniske vaskemidler ⁸ å trekke ønskede target proteiner, og bruken av en spesiell vaskemiddel avhenger målprotein og kjent membran menneskehandel. Her utnytter vi ikke-denaturerende og ikke-ionisk detergent IGEPAL CA-630 til å trekke ut palmitoylated proteiner, som vi har validert for utvinning og påvisning av det palmitoylated neuronal proteinekstravasasjon δ-catenin (Figur 2). Strukturen av IGEPAL CA-630 inneholder en klumpete og stivt ikke-polart hodegruppe som ikkeforstyrre innfødte protein konformasjon eller interaksjoner, men som muliggjør tilknytning til hydrofobe regioner av membran-assosierte proteiner, og dermed overdrar blandbarhet til dem og tillater deres utvinning. Mange neuronale proteiner lokalisert til den synaptiske membran eller postsynaptiske tetthet av synapser bør utvides ved å bruke IGEPAL CA-630, men noen kan ikke helt solubilisere, og kan kreve bruk av en annen ikke-denaturerende vaskemiddel som Triton X-100, som har tidligere brukt til ABE ^{2 kjemi, 8.}

Flere beskrivelser av ABE kjemi har også anvendt et forskjellig tiol-reaktivt biotinylation reagens fra molekylet vi beskriver her, kalt Biotin-HPDP (Thermo Scientific), som også nødvendiggjør en annen metode for proteinrensing ^4. Biotin-HPDP er en annen tiol-reaktiv maliemide-konjugert biotin molekyl som inneholder en disulfidbinding i maliemide linkerarm, strukturelt differentiating det fra Biotin-BMCC, som ikke inneholder denne disulfidbinding. Etter tiol-biotinylation av et protein gratis eller palmitoylated cystein Biotin-HPDP, kan den resulterende disulfidbinding mellom målproteinet og biotin gruppen bli spaltet ved å redusere reagenser å frigjøre biotin gruppen og regenerere proteinet i sin umodifiserte form, noe som gjør biotinylation av Biotin-HPDP forbigående og reversible. Derfor kan bruk av denne biotinylation reagens trenger rensing av et målprotein etter immobiliserte avidin reagenser, for eksempel streptavidin-belagte perler. Imidlertid, tiol-biotinylation av et målprotein fra Biotin-BMCC, som vi beskriver her, er stabil og relativt permanent, og krever rensing av målproteinet ved et antistoff rettet mot målet, og immobilisert på Sepharose-kuler. Begge ABE teknikker er tidligere benyttet for storskala skjermer, og påvisning av palmitoylation av single proteiner ^{2, 8-10, 12,} og denIP-ABE analysen vi beskriver her er optimal for rask påvisning av palmitoylation av enkle nevrale target proteiner.

Et overveldende flertall av mobilnettet palmitoylation innebærer reversible tillegg av palmitate til tiolgruppe av cysteinene (kalt S-palmitoylation, som vi generalisere som "palmitoylation" i denne protokollen), er imidlertid en svært begrenset gruppe av proteiner utsatt for irreversibel palmitoylation på glysin og cysteinrester gjennom dannelsen av stabile amidbindinger, betegnet N-palmitoylation ^13. En begrensning ABE kjemi er dens manglende evne til å påvise N-palmitoylation grunn av stabiliteten i amidbinding, og så screening av en roman målprotein for palmitoylation bør bekreftes ved hjelp av 3H-palmitat metabolsk merking ^1.

Som tidligere nevnt, kan IP-ABE analysen lett tilpasses for behandlingen palmitoylation i proteinekstrakter fra flere kilder, inkludert transfected heterologe cellelinjer, primær vev, og primære neuronal kulturer fra flere områder av hjernen. IP-ABE analysen har vært benyttet for å undersøke palmitoylation tilstrekkelighet av muterte cystein-til-serin proteiner for å identifisere plasseringen av en palmitoylated cystein langs et mål protein ^8, for å undersøke dynamiske palmitate omsetning på synaptiske proteiner i dyrkede nerveceller i henhold basale forhold ^10, og endringer i palmitoylation nivåer av nevronale proteiner etter induksjon av neuronal aktivitet ^9. Følsomheten og tilpasningsevne av IP-ABE analysen gjør den ideell for å undersøke palmitoylation profiler av neuronal proteiner, og optimal for å oppdage dynamiske endringer i palmitoylation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
PMSF	Fluka	93482
Protease Inhibitor Cocktail	Roche Complete Mini	11 836 153 001
NEM	Sigma	E3876
HAM solution	Sigma	46780-4
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads	GE Healthcare	17-6002-35
Biotin-BMCC	Thermo Scientific	21900
Streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21126	Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	21059