Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

doi: 10.3791/50058 Published: February 2, 2013

Summary

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Abstract

L'immunothérapie du cancer permet d'exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d'antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques 1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR + lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l'hôte, et enfin à induire l'apoptose de CAR + Les cellules T dans le cas de 5 toxicité hôte.

La délimitation des fonctions optimales de CAR + lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l'imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l'étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo 6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d'une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles 8.

Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l'espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes 9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d'effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d'imagerie d'un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d'une seule cellule qui peut être largement appliquée à l'étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l'HEPES et de la solution.
  2. Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l'addition.
  3. Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles.
  4. Fabrication des tableaux de nanowells dans PDMS: Le maître de silicium est fabriqué en utilisant la photolithographie essentiellement comme décrit précédemment 10. Bien mélanger le Sylgard 184 kit de base élastomère et le durcisseur 10:1 poids dans un gobelet jetable en utilisant un couteau en plastique. Dégazer le mélange dans une chambre à vide pendant 1 heure. Verser le mélange sur le tableau nanowell, sceller avec une lame de verre et laissez-le reposer pendant 30 min. Transfert de l'ensemble dans un four réglé à 80 ° C pendant 2 heures et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. L'élastomère sera actue au cours de cette période et la volonté de se lier à la lame de verre. La lame de verre contenant le réseau PDMS nanowell est soigneusement décollé le maître silicium, recouvert avec du scotch et stocké jusqu'à son utilisation future.

2. Cellule cible (T) Marquage

  1. Compter 5 millions de cellules de culture de cellules cibles à l'aide d'un hémocytomètre et sédimenter les cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. La culture de cellules est divisé le jour précédent dans 5 ml de volume total (densité = 1 millions / ml) et cultivées en flacon T-25 (VWR). Protocoles pour le comptage des cellules à l'aide hémocytomètre ont été décrits en détail antérieurement 11
  2. Aspirer les supports en excès, laissant derrière d'environ 50 pi de médias.
  3. Préparer une solution de travail de la cellule Tracker Rouge (CTR) en mélangeant 0,5 ul de stock CTR (1 mM) à 150 ul de RPMI-PLGH (concentration finale 2,5 uM). Ajouter 150 ul de la solution de travail aux cellules cibles et bien mélanger à l'aide d'une pipette P200.Alternativement, PKH 26 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant.
  4. Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min.

3. Marquage cellulaire effectrice (E)

  1. Compter 5 millions de cellules effectrices de culture de cellules à l'aide d'un hématimètre et le culot des cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min.
  2. Aspirer les supports en excès
  3. Préparer une solution de travail de Vybrant solution Stain DyeCycleViolet en ajoutant 1 pl de 5 stock Violet mM Vybrant à 1 ml de R10 médias (concentration finale de 5 uM). Ajouter la solution de travail à l'aide de cellules et remettre en suspension P200 pipette. Alternativement, PKH 67 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. Si PKH 67 est utilisé, alors SYTOX vert ne doit pas être utilisés car ils sont dans le même canal de fluorescence. L'énumération des objectifs de apoptotiques se fait exclusivement en utilisant uncoloration nnexinV dans ce cas.
    Remarque: Si vous effectuez time-lapse et les mesures de point final non, colorants UV comme Violet Vybrant doit être évitée.
  4. Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min.

4. Séparation des cellules vivantes et mortes par gradient de densité

  1. Ajouter 6,8 ml et 6,0 ml de RPMI-PLGH à la cible et les cellules effectrices, respectivement, et mélanger par pipetage de haut en bas doucement.
  2. Couche de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus à fond de chaque tube conique contenant la cible et les cellules effectrices. La couche FICOLL lentement pour assurer une bonne formation de couches entre FICOLL et des médias.
  3. Centrifuger les deux tubes à 340 xg pendant 30 min. sans frein et d'accélération.
  4. Lors de la centrifugation, transférer 7 ml de PBS préchauffé à une plaque 4-bien. Préparer ensemble nanowell (fabriqué en PDMS): pour nettoyer le fond de la lame de verre avec de l'éthanol et de l'oxydation du PDMS au réglage élevé RF à l'aide d'oxydation plasma pendant 1 min. Cette étape va sterilize la matrice, tout en rendant nanowell le PDMS hydrophile. Immédiatement déplacer la baie nanowell dans la plaque contenant du PBS.
  5. Placer la plaque d'une enceinte de biosécurité et aspirer excès de PBS. Faire 10 ml 1% de gélose noble par addition de 100 mg de poudre d'agar 10 ml d'eau déminéralisée, puis au micro-ondes pendant 30-45 sec. Appliquer réchauffer 1% d'agar noble sur le bord supérieur et inférieur de lame de verre qui contient le tableau nanowell pour immobiliser le réseau et attendre 10 minutes pour solidifier la gélose à. Ajouter 3 ml de PBS et aspirée agar excès.
  6. Ajouter 3 ml de R10 sur le haut de gamme nanowell et le laisser s'équilibrer pendant environ 10 min.
  7. Après la centrifugation sur Ficoll, aspirer 5 ml de milieu de la couche supérieure de chaque tube. Attention de ne pas aspirer la couche contenant les cellules.
  8. Récolter les cellules (couche blanche) en récupérant 1-2 ml de la couche entre FICOLL et les médias avec P1, 000 pipette et passage à de nouveaux tubes coniques stériles. Répétez cette opération pour les deux ensembles de cellules tout en veillant à ce que vous maximeiser les cellules de récupération.
  9. Ajouter 3 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH dans chaque tube, mélanger par pipetage et par centrifugation à 340 g pendant 5 min à pleine accélération et de freinage.
  10. Aspirer les supports en excès, ajouter 5 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH à chaque tube et répétez centrifugation à 340 xg pendant 5 min.
  11. Aspirer les supports en excès et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pl de R10.
  12. Compter les cellules vivantes en utilisant la méthode d'exclusion du bleu trypan sur un hématimètre.

5. Chargement en cours cellule sur tableau Nanowell

  1. Aspirer les supports en excès gamme nanowell et ajouter 2 ml de R10 frais à travers le réseau. Aspirer à nouveau tout en s'assurant que le haut de gamme nanowell n'est pas trop humide / sec car il aura une incidence sur la distribution des cellules.
  2. Des dépôts 1 x 10 5 cellules effectrices dans 200 pl de R10 sur une surface large nanowell (densité = 5 x 10 5 cellules / ml).
  3. Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour ens'assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire.
  4. Dépôt de garantie 1 x 10 5 cellules cibles dans 200 ul R10 sur nanowell surface de réseau (densité = 5 x 10 5 cellules / ml).
  5. Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour s'assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire.
  6. Rincer soigneusement à l'ensemble nanowell 2 ml R10 et aspirer les supports en excès.
  7. Préparer 3 ml préchauffé R10 dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 3 pi de 0,5 mM SYTOX vert Nucleic Acid Stain (concentration finale de 0,5 uM) et 60 pl de l'annexine V-Alexa Fluor 647 pour préparer la solution de travail. Ajouter la solution de travail sur la plaque 4-bien attentivement tout en s'assurant que les cellules ne sont pas déplacés dans les puits.
  8. Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 15 min.

6. Image 1

  1. Acquérir des images de la matrice en utilisant une encre magnétique nanowell fluorescenceoscope: Dans cet exemple, nous utilisons un observateur ZEISS Z-1 microscope équipé d'une platine motorisée et Lambda-DG4.
  2. Initialiser le logiciel et le microscope et vérifier l'intensité du signal de la lumière transmise et les autres canaux fluorescents. Dans l'ensemble, il y aura cinq canaux correspondant à: la lumière transmise, l'annexine V-647 (Cy5 filtre), CTR (DsRed filtre), SYTOX vert (filtre FITC), et Vybrant Violet (DAPI filtre). Assurez-vous que le microscope il configuré pour assurer un signal au bruit maximal tout en évitant la saturation.
  3. Réglez la position X et Y de la matrice nanowell. Début du processus de réglage de la position zéro et initialiser l'accent sur le centre de 7 x 7 Bloc de réseau nanowell sur le coin supérieur gauche de la matrice nanowell timbre. Réglez les positions X, Y pour les faire coïncider avec le centre de chaque bloc et la valeur z pour refléter fidèlement l'accent sur chaque bloc.
  4. Une fois la position et l'orientation constituent tous ensemble, assurez-vous de régler l'acquisition d'images en mode linéaire et acquérir des images. 2 sur le microscope au moins 30 min avant l'expérience.

7. Post-imagerie

Placer la plaque 4-puits contenant le tableau nanowell dans un incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant 6 heures.

8. Imagerie 2

Acquérir les images à la seconde fois, le point comme il est indiqué à l'étape 6.

9. Analyse d'images

  1. L'occupation des cellules dans la nanowells est déterminée par l'utilisation de programmes appropriés de segmentation d'image (par exemple ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ), essentiellement comme décrit précédemment 9,12.
  2. Analyse de la première série d'images de microscope (t = 0 h, t 0) est utilisée pour générer une base de données des nanowells individuels contenant exactement une cellule cible en temps réel (identifiéspar CellTracker rouge, rouge) et pas de cellules mortes (identifié par l'annexine V coloration, vert) [T1T 0 nanowells].
  3. Analyse du second ensemble d'images de microscope (t = 6 h, t 6) est utilisé pour déterminer de manière indépendante une seconde base de données contenant des nanowells 1 cellule cible (rouge) [6 T1T nanowells]. Un contrôle d'intégrité (requête de base de données) est mis en œuvre pour s'assurer que toutes les cibles vivantes à t 0 sont adaptés aux objectifs à t 6 pour produire un ensemble final de cibles appariées (mis en œuvre nanowells qui ont T1T 0 = T1T 6, désigné comme T1match)
  4. Le nombre de cellules effectrices dans nanowells est déterminée en utilisant une coloration violette Vybrant à l'instant t 0 [nanowells E1]
  5. Une requête de base de données est mis en œuvre pour identifier nanowells contenant effecteurs simples co-incubées avec des objectifs simples (définie comme nanowells qui ont du match E1 et T1, désignés comme E1T1)
  6. Effecteur l'apoptose induite est marqué par i DENTIFIER cibles qui sont annexine V négatif à l'instant t 0 et l'annexine V positif à l'instant t 4 (E1T1 avec coloration annexine V cible à l'instant t 6).

10. En option imagerie time-lapse de l'abattage Utilisation de Nikon BioStation IM

  1. Prenez une boîte de Pétri à fond la lamelle et couper un petit morceau de la puce de réseau nanowell (préparé à l'étape 5) qui s'adaptent exactement sur la lamelle. Assurez-vous que la puce reste humide pendant la coupe.
  2. Mélanger 1 x 10 6 cibles et 1 x 10 6 cellules T dans 100 ul de médias, et il pipette sur la lamelle.
  3. Prévoyez environ 15-30 minutes pour laisser les cellules se déposent.
  4. Rapidement inverser la puce petit tableau nanowell et le placer sur la lamelle.
  5. Afin de s'assurer que la puce ne sera pas capable de se déplacer pendant l'imagerie, le lieu d'une ou deux lamelles 20mm x 20mm sur la partie supérieure de la puce. Appliquer une pression pour pousser doucement la puce au fond de la cuvette.
tente "> Remarque: Le fond de la puce de réseau nanowell est trop épais pour l'imagerie haute résolution et doit donc être renversé Pendant ce temps, la plupart des cellules sont lavées Puisque cela peut ne pas être facilement contrôlées, le nombre de cellules à l'étape 9.2.. et le temps d'incubation de l'étape 9.3 doivent être optimisés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Un exemple de l'application de l'analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR + cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d'un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l'occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6). Traitement de l'image a été utilisée pour identifier tous les nanowells contenant exactement une seule cible et un effecteur unique et d'exclure nanowells contenant des cibles mortes (article 9). La puce a été transféré à un incubateur pendant 6 h, puis une seconde image de la puce a été enregistrée (Sections 7-8). La capacité d'effecteur d'induire l'apoptose dans les cellules cibles a été mesurée par coloration avec l'annexine V, en nanowells contenant exactement une cible et un effecteur. Deux expériences parallèles ont été effectuées avec les mêmes effecteurs et deux ensembles odes cellules cibles EL4 (f-CD19 + et CD19-EL4-(témoin négatif)) pour déterminer la fréquence de l'antigène spécifique de lyse (Figure 2). Il est souhaitable d'obtenir des basses fréquences non spécifique de lyse (~ 2-4%). La méthode dépend de la disponibilité des cellules cibles appropriées et des expériences parallèles sont effectués pour déterminer l'apoptose dans les objectifs indépendants des effecteurs. Des fréquences élevées de l'apoptose cible en l'absence d'effecteurs au cours de la période de 6h (> 8%) indique un besoin d'optimiser la culture et des conditions de dosage. Le tableau nanowell peut être adapté pour imagerie time-lapse lorsque la surveillance continue est nécessaire (Film 1), ce qui permet l'observation d'effecteur-cible conjugaison et après la mort cellulaire.

Figure 1
Figure 1. A. Schéma d'ensemble nanowell essai cytolytique base. Labellisé CAR +Les cellules T (bleu) et les cellules cibles (rouge) sont incubés dans un tableau de nanowells. Microscopie est utilisée pour surveiller effecteur cytolyse médiée cible. B. micrographies représentatives composites de CD19 spécifique CAR + cellules T qui induisent l'apoptose dans EL4-CD19 + cellules cibles et ceux qui n'en ont pas.

Figure 2
Figure 2. Spécifiques de l'antigène CD19 activité cytolytique spécifique du CAR + cellules T. Parcelles de cellules cibles histogramme de puits contenant un effecteur unique et une seule cible après 6 heures de co-incubation. Histogrammes correspondent à des cellules cibles sans effecteurs sont présentés à signaler la fréquence de la mort cellulaire de fond.

Film 1. Time-lapse de microscopie CAR + T-cell cytolyse médiée. CAR + cellules T (sans étiquette) ont été co-incubées avec NALM-6-GFP cellules cibles + (vert) dans un nanowell et les images ont été prises toutes les 2 min pour un total de 12 heures pour permettre un suivi dynamique. Annexine V a été ajouté au milieu de culture et les cellules apoptotiques marqués deviennent rouge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d'essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d'un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l'ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l'utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules tumorales que les cellules cibles. Le confinement spatial permet la récupération et le clonage ultérieur des fonctions des cellules T à la fin de l'essai 9. Une limitation de l'essai est la nécessité pour les microscopes spécialisés avec des étapes automatisées et optiques à commutation rapide. Ce n'est cependant pas une limitation sérieuse étant donné que ces machines sont maintenant largement disponibles dans le cadre d'installations de base de la recherche.

Il existe une variété de cytométrie en flux qui offrent des analyses basées sur un débit plus élevé tout en preserving seule cellule de résolution. Ceux-ci comprennent des essais qui se colorent pour le marqueur de substitution de la dégranulation (CD107a) ou le contenu de la perforine dans effecteurs et la caspase / activité granzymes dans les objectifs de 13,14. Ces tests ne sont cependant pas vraiment surveiller effecteur-cible conjugaison ou la capacité de l'effecteur d'engager et de tuer des cibles multiples. Par rapport à l'essai de l'étalon-or comme une 4h 51Cr-release dosage, tourner à E: T ratios de 1:1, notre méthodologie rapporte généralement le même nombre global des effecteurs cytolytiques, tout en fournissant une seule cellule de résolution. Bien que le protocole décrit ici que des détails sur la cytotoxicité, comme indiqué précédemment ce test peut être facilement combiné avec le test microengraving pour déterminer cytokines sécrétées par les cellules effectrices simples sur 9 ligature cible. Il est ainsi possible de générer des profilés composites fonctionnels du RAC cellules T qui combinent la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines au niveau d'une seule cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

La recherche publiée dans la présente publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous R01CA174385 Nombre Award. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine Cellgro 15-040-CV
Penicillin-streptomycin Cellgro 30-002-CI 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine Cellgro 25-005-CI 200 mM solution
HEPES Sigma Aldrich H3537 1M
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150 Lot tested
Cell Tracker Red Stain Invitrogen C34552 50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain Invitrogen V35003 5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647 Invitrogen A23204 500 μl
Dulbecco's PBS Cellgro 21-031-CV 500 ml
Noble agar DIFCO 2M220 100 g
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154 0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer Hausser Scientifics 1492 Bright line
4-well plate Thermo Fisher 167603
Harrick Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Basic plasma cleaner
Observer.Z1 ZEISS Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3 Sutter Instrument Filter controller
Lambda DG-4 Sutter Instrument Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera Hamamatsu C9100-13 CCD-Microscope camera
15 ml conical tube BD Falcon 352097
50 ml conical tube VWR 3282-345-300
Nikon Biostation Nikon Instruments Inc. Biostation IM
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0 35 mm petri dish, 10 mm microwell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
  2. Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
  3. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
  4. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. (2011).
  5. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
  6. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  7. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
  8. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
  9. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  10. Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
  11. Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
  12. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
  13. Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
  14. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liadi, I., Roszik, J., Romain, G., Cooper, L. J. N., Varadarajan, N. Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells. J. Vis. Exp. (72), e50058, doi:10.3791/50058 (2013).More

Liadi, I., Roszik, J., Romain, G., Cooper, L. J. N., Varadarajan, N. Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells. J. Vis. Exp. (72), e50058, doi:10.3791/50058 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter