Summary
We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.
Abstract
Immunotherapie van kanker kunnen benutten van de specificiteit van immuunrespons op te richten en te elimineren tumoren. Adoptieve celtherapie (ACT) gebaseerd op de adoptieve overdracht van T-cellen genetisch gemodificeerd om een chimeer antigen receptor (CAR) expressie blijkt aanzienlijke belofte in klinische proeven 1-4. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik CAR + T cellen voor de behandeling van kanker inclusief de mogelijkheid om niet-MHC beperkte antigenen te richten en de T-cellen voor optimale overleving, homing en persistentie in de gastheer functionaliseren en uiteindelijk apoptose induceren van CAR + T-cellen bij ontvangst toxiciteit 5.
Afbakening van de optimale functies van CAR + T cellen geassocieerd met klinische voordelen zijn essentieel voor het ontwerpen van de volgende generatie klinische trials. Recente ontwikkelingen in levende dieren imaging zoals multifoton microscopie hebben een revolutie in de studie van de immuun cel functie in 6,7 vivo. Hoewel deze studies hebben ons begrip van T-cel functie in vivo, T-cel-gebaseerde ACT in klinische proeven vereist de noodzaak moleculaire en functionele kenmerken van T-cel preparaten koppelen pre-infusie met klinische werkzaamheid na de injectie door gebruik in vitro testen bewaken T-cel functies zoals, cytotoxiciteit en cytokine secretie. Flow-cytometrie standaard gebaseerde testen ontwikkeld die bepalen de algemene werking van populaties van T-cellen in de eencellige niveau, maar deze zijn niet geschikt voor het bewaken conjugaat vorming en levens of het vermogen van dezelfde cel te doden meerdere doelen 8.
Microfabricated arrays ontworpen biocompatibele polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) een bijzonder aantrekkelijke methode om ruimtelijk beperken effectoren en targets in kleine volumes 9. In combinatie met automatische time-lapse fluorescentiemicroscopie, thousands van effector-target interacties gelijktijdig monitoren door beeldvorming afzonderlijke putjes van een nanowell array. We stellen hier een high-throughput methode daartoe T-cel gemedieerde cytotoxiciteit bij de eencellige niveau breed toepasbaar voor onderzoek naar de functies van cytolytische T-cellen.
Protocol
1. Reagentia Voorbereiding
- Bereid RPMI-PLGH door mengen 500 ml RPMI-1640 en 5 ml elk van penicilline-streptomycine, L-glutamine en HEPES oplossing.
- Bereid R10 oplossing mengen RPMI-PLGH met 10% foetaal runderserum (FBS). De FBS is hitte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging.
- Voorverwarmen bij 37 ° C 50 ml van RPMI-PLGH, 15 ml PBS en 15 ml R10 in steriele conische buizen.
- Fabricage van arrays van nanowells in PDMS: De silicium master vervaardigd met behulp van fotolithografie in hoofdzaak zoals eerder beschreven 10. Meng grondig de Sylgard 184 elastomeer kit basis en verharder in 10:01 gewichtsverhouding in een wegwerp beker met behulp van een plastic mes. Ontgas het mengsel in een vacuümkamer gedurende 1 uur. Giet het mengsel op de nanowell array, sluiten met een glaasje en laat het zitten voor 30 minuten. Breng het geheel in een oven op 80 ° C gedurende 2 uur en laat afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het elastomeer zal huidige tijdens deze periode en wil binding met het glas dia. De glazen dia met de PDMS nanowell array voorzichtig opgetild van de silicium meester, bedekt met Scotch tape en opgeslagen tot toekomstig gebruik.
2. Target Cell (T) Etikettering
- Tel 5 miljoendoelstelling cellen van celkweek met behulp van een hemocytometer en de pellet cellen in een steriele 15 ml conische buis door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten. De celkweek wordt gesplitst de dag in 5 ml totaal volume (dichtheid = 1 miljoen / ml) en gekweekt in T-25 kolf (VWR). Protocollen voor celtelling met hemocytometer zijn beschreven in detail eerder 11
- Zuig al het papier met achterlating van ongeveer 50 ul van de media.
- Bereid een werkoplossing van Cell Tracker Rood (CTR) door mengen 0,5 ui CTR voorraad (1 mM) tot 150 pi RPMI-PLGH (eindconcentratie 2,5 uM). Voeg 150 pi van de werkoplossing de doelcellen en meng met een P200 pipet.Als alternatief kan PKH 26 (eindconcentratie van 2 uM) worden gebruikt label doelcellen volgens de instructies van de fabrikant.
- Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 20 min.
3. Effector (E) Mobiele Labeling
- Tel 5000000 effectorcellen van celkweek met behulp van een hemacytometer en pellet van de cellen in een steriele 15 ml conische buis door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig al het papier
- Bereid een werkoplossing van Vybrant DyeCycleViolet Stain oplossing door toevoeging van 1 pi 5 mM Vybrant Violet stock aan 1 ml R10 media (eindconcentratie van 5 uM). Voeg de werkoplossing voor de cellen en resuspendeer met P200 pipet. Als alternatief kan PKH 67 (eindconcentratie van 2 uM) worden gebruikt label doelcellen volgens de instructies van de fabrikant. Als PKH 67 wordt gebruikt, dan SYTOX Green mogen niet worden gebruikt omdat ze in dezelfde fluorescentie kanaal. De opsomming van apoptotische doelstellingen gebeurt uitsluitend met behulp van eennnexinV kleuring in dit geval.
Opmerking: Bij het uitvoeren van time-lapse en niet eindpunt metingen UV kleurstoffen zoals Vybrant Violet moet worden vermeden. - Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 20 min.
4. Scheiding van levende en dode cellen door een dichtheidsgradiënt
- Voeg 6,8 ml en 6,0 ml van RPMI-PLGH te richten en effector cellen, respectievelijk en meng door pipetteren en zachtjes.
- Laag 3,5 ml Ficoll-Paque Plus onderaan elke conische buis die doel en effectorcellen. Leg de FICOLL langzaam om een goede vorming van lagen tussen FICOLL en media te garanderen.
- Centrifugeer beide buizen bij 340 xg gedurende 30 minuten. zonder rem en versnelling.
- Tijdens centrifugeren overdragen 7 ml voorverwarmde PBS een 4-well plaat. Bereid nanowell array (gefabriceerd in PDMS): bodemstofzuiger glasplaatje met ethanol en oxideren PDMS bij hoge RF instelling met plasma oxidatiemiddel gedurende 1 min. Deze stap zal sterilize de nanowell array terwijl ook waardoor de PDMS hydrofiel. Onmiddellijk zet de nanowell array naar de plaat met PBS.
- Breng de plaat op een bioveiligheid kast en zuig overtollige PBS. Maak 10 ml 1% edele agar door het toevoegen van 100 mg agar poeder aan 10 ml gedeïoniseerd water en daarna magnetron het gedurende 30-45 sec. Breng opwarmen 1% edele agar op de boven-en onderrand van glasplaatje dat de nanowell array om de array te immobiliseren en wacht 10 minuten voor agar te stollen bevat. Voeg 3 ml PBS en zuig overtollige agar.
- 3 ml R10 op de bovenkant van nanowell array en laat equilibreren ~ 10 min.
- Na centrifugatie Ficoll, zuig 5 ml inhoud van de toplaag van elke buis. Zorg ervoor dat u de laag met de cellen te zuigen.
- Oogst de cellen (witte laag) door het winnen van 1-2 ml van de laag tussen FICOLL en media met P1, 000 pipet en verhuis naar nieuwe steriele conische buizen. Herhaal dit voor beide groepen van cellen terwijl ervoor te zorgen dat je stelregelize het herstel cellen.
- 3 ml voorverwarmde RPMI-PLGH aan elke buis mengen door pipetteren en pellet door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten op volle optrekt en remt.
- Zuig al het papier, voeg 5 ml voorverwarmde RPMI-PLGH aan elke buis en herhaal centrifugeren bij 340 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het medium en resuspendeer de celpellet in 500 pi R10.
- Tellen levende cellen met de Trypan blauw exclusie methode op een hemacytometer.
5. Mobiele Laden op Nanowell Array
- Zuig al het papier uit nanowell array en voeg 2 ml vers R10 over de array. Zuig weer terwijl het maken van dat de bovenkant van nanowell array is niet te nat / droog als het zal verdeling van cellen beïnvloeden.
- Deposit 1 x 10 5 effector cellen in 200 pi R10 op nanowell matrix oppervlak (dichtheid = 5 x 10 5 cellen / ml).
- Laat cellen rusten gedurende 5 minuten en bij een standaard weefselkweek microscoop cheque aan enof de verdeling van cellen gewenst is. Voeg meer cellen indien nodig.
- Deposit 1 x 10 5 doelcellen in 200 ui R10 op nanowell matrix oppervlak (dichtheid = 5 x 10 5 cellen / ml).
- Laat cellen rusten gedurende 5 min en bij een standaard weefselkweek microscoop controleren dat de verdeling van cellen gewenst is. Voeg meer cellen indien nodig.
- Zorgvuldig spoelen nanowell array met 2 ml R10 en zuig overtollige media.
- Bereid 3 ml voorverwarmde R10 in een 15 ml steriele conische buis. Voeg 3 pl 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (eindconcentratie 0,5 uM) en 60 ui Annexine V-Alexa Fluor 647 tot werkoplossing te maken. Voorzichtig de werkende oplossing op de 4-well plaat terwijl ervoor te zorgen dat cellen niet worden verplaatst uit de putjes.
- Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 15 min.
6. Imaging 1
- Acquire beelden van de nanowell array met behulp van een fluorescentie microscope: In dit voorbeeld gebruiken we een ZEISS Observer Z-1 microscoop uitgerust met een gemotoriseerde podium en Lambda-DG4.
- Initialiseer de software en de microscoop en controleer de signaalintensiteit van het doorgelaten licht en andere fluorescerende kanalen. Overall, er vijf kanalen overeenkomstig: doorgelaten licht, Annexine V-647 (Cy5 filter), CTR (DsRed filter), SYTOX Green (FITC filter) en Vybrant Violet (DAPI filter). Zorg ervoor dat de microscoop te stellen met de maximale signaal naar ruis terwijl het vermijden van verzadiging.
- Stel X en Y positie voor de nanowell array. Begin proces door het instellen van de nulstand en het initialiseren van focus op het midden van 7 x 7 nanowell scala blok aan linker bovenhoek van de nanowell reeks stempel. De x, y posities samenvallen met het middelpunt van elk blok en de z-waarde nauwkeurig de nadruk op elk blok.
- Zodra de positie en focus zijn helemaal klaar, zorg ervoor dat beeldopname in lineaire mode en beelden te verwerven.
7. Post-imaging
Breng de 4-wells plaat met de nanowell array in een incubator (37 ° C / 5% CO 2) gedurende 6 uur.
8. Imaging 2
Het verwerven van de beelden op de tweede keer-punt, zoals beschreven in stap 6.
9. Beeldanalyse
- De bezetting van cellen in de nanowells wordt bepaald door het gebruik van geschikte beeldsegmentatie programma's (bijvoorbeeld ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) in hoofdzaak zoals eerder beschreven 9,12.
- Analyse van de initieel geselecteerde microscoopbeelden (t = 0 uur, t 0) wordt gebruikt om een database van de individuele nanowells met precies een levende doelcel (geïdentificeerd genererendoor CellTracker Red, red) en geen dode cellen (geïdentificeerd door Annexine V kleuring, groen) [T1t 0 nanowells].
- Analyse van de tweede reeks microscoopbeelden (t = 6 uur, t 6) wordt gebruikt om zelfstandig een tweede database nanowells met een doelcel (red) [T1t 6 nanowells]. Een integriteitscontrolewaarde (database query) wordt toegepast om alle levende doelen op t 0 zijn afgestemd op doelen op t 6 tot een uiteindelijke set van trefwoorden targets (geïmplementeerd als nanowells dat T1t 0 = T1t 6, aangeduid als T1match hebben) produceren
- Het aantal effectorcellen in nanowells bepaald volgens Vybrant Violet kleuring op t 0 [E1 nanowells]
- Een database query wordt uitgevoerd om nanowells die enkelvoudige effectors identificeren geco-incubeerd met enkelvoudige doelen (gedefinieerd als nanowells dat E1 en T1 match hebben aangeduid als E1T1)
- Effector geïnduceerde apoptose wordt gescoord door i dentifying doelen die zijn Annexine V negatief op t 0 en Annexine V positief op t 4 (E1T1 met Annexine V doelgroep vlekken op t 6).
10. Optionele Time-lapse imaging van Killing gebruik van Nikon's BioStation IM
- Neem een petrischaal met dekglas onderkant en snijd een klein stukje van de nanowell array chip (bereid in stap 5) die precies past op het dekglaasje. Zorg ervoor dat de chip natte blijft tijdens het snijden.
- Mix 1 x 10 6 targets en 1 x 10 6 T-cellen in 100 ul media, en op het dekglaasje pipet.
- Laat ongeveer 15-30 minuten te laten de cellen af te wikkelen.
- Snel Keer de kleine nanowell array chip en plaats het op het dekglaasje.
- Om ervoor te zorgen dat de chip niet kunnen bewegen tijdens de beeldvorming, plaats een of twee 20mm x 20mm dekglaasjes op de bovenkant van de chip. Breng druk zachtjes de chip druk om de bodem van de schaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van de toepassing van de high-throughput cytolytische assay aangetoond in figuur 2. Kort, gemerkt CD19-specifieke CAR + T-cellen werden geco-incubeerd met gelabelde muizen EL4 doelcellen in de afzonderlijke putjes van een nanowell array (hoofdstukken 1-5). Een eerste beeld werd opgenomen op de geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop om de bezettingsgraad (effectoren en / of doelstellingen) van elke nanowell te identificeren op de array (hoofdstuk 6). Beeldverwerking werd gebruikt om alle nanowells, welke laatste precies een enkel doel en een effector te identificeren en nanowells met dode doelstellingen (hoofdstuk 9) uit te sluiten. De chip werd overgebracht naar een incubator voor 6u en dan een tweede beeld van de chip werd opgenomen (paragrafen 7-8). Het vermogen van effector om apoptose te induceren in doelcellen werd gemeten door kleuring met Annexine V, in nanowells met precies een effector en een doel. Twee parallelle experimenten werden uitgevoerd met dezelfde effectoren en twee sets of doelcellen (EL4-CD19 + en CD19-EL4-(negatieve controle)) om de frequentie van antigeen-specifieke lysis (figuur 2) bepalen. Het is wenselijk lage frequenties van niet-specifieke lysis (~ 2-4%) te bereiken. De methode is afhankelijk van de beschikbaarheid van passende doelcellen en parallel experimenten uitgevoerd om apoptose in targets onafhankelijk van effectoren te bepalen. Hoge frequenties van doel apoptose in afwezigheid van effectors de 6h periode (> 8%) leert dat een kweek en testomstandigheden optimaliseren. De nanowell array kan worden aangepast voor time-lapse imaging bij continue monitoring nodig is (Film 1) en dit maakt het mogelijk voor de observatie van effector-target conjugatie en de daarop volgende cel-dood.
Figuur 1. A. Schema van nanowell array gebaseerde cytolytische test. Labelled CAR +T-cellen (blauw) en doelcellen (rood) worden geïncubeerd in een reeks nanowells. Microscopie gebruikt om effector bemiddelde cytolyse doel volgen. B. Vertegenwoordiger composiet microfoto van CD19-specifieke CAR + T-cellen die apoptose te induceren in EL4-CD19 + doelcellen en degenen die dat niet doen.
Figuur 2. Antigeen-specifieke cytolytische activiteit van CD19-specifieke CAR + T-cellen. Doelcel histogram plots kommetjes met daarin een effector en een doel na 6 uur co-incubatie. Matched histogrammen van doelwitcellen zonder effectors getoond de frequentie van celdood achtergrond geven.
Movie 1. Time-lapse microscopie van CAR + T-cel gemedieerde cytolyse. CAR + T-cellen (gemerkte) werden samen geïncubeerd met NALM-6-GFP + doelcellen (groen) in een naNowell en beelden werden elk 2 minuten in totaal 12 uur dynamische monitoring mogelijk. Annexine V werd toegevoegd aan het kweekmedium en apoptotische cellen worden gemerkt rood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben geschetste protocol voor een high-throughput eencellige cytolytische assay geactiveerd door co-incubatie van effectors en doelen in arrays van nanowells (figuur 1). Naast throughput een belangrijk voordeel van de techniek is de mogelijkheid om effector-gemedieerde cytotoxiciteit tegen gewenste doelcellen volgen zonder doelcel techniek wat op zijn beurt het gebruik van autologe of matched / primaire tumorcellen als doelcellen. De ruimtelijke opsluiting maakt het ophalen en daaropvolgende klonering van functionele T-cellen aan het einde van de test 9. Een beperking van de assay is de behoefte aan speciale microscopen met geautomatiseerde stappen en snel schakelen optiek. Dit is echter niet een serieuze beperking gezien het feit dat deze machines nu op grote schaal beschikbaar als onderdeel van het onderzoek kernfaciliteiten.
Er zijn een verscheidenheid van flow-cytometrie gebaseerde testen die hogere doorvoer bieden terwijl preserving eencellige resolutie. Deze omvatten testen die vlek voor de surrogaat marker voor degranulatie (CD107a) of perforine inhoud in effectoren en caspase / granzymen activiteit in targets 13,14. Deze assays echter niet werkelijk controleren effector-target conjugatie of het vermogen van de effector te gaan en te doden meerdere doelen. In vergelijking met de gouden standaard test zoals een 4h 51Cr-afgifte test, uitgevoerd op E: T ratio van 1:1, onze methodologie meldt meestal dezelfde totale aantal cytolytische effectoren, terwijl het toch eencellige resolutie. Hoewel de beschreven protocol hier alleen informatie over cytotoxiciteit, zoals eerder beschreven deze assay kan gemakkelijk worden gecombineerd met de microengraving assay cytokines bij een enkele effector cellen na ligatie doel 9 bepalen. Het is dus mogelijk te genereren samengestelde functionele profielen van CAR + T-cellen die cytotoxiciteit en cytokine secretie in de eencellige niveau combineren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal R01CA174385. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
