Summary
نحن وصف وحيدة الخلية الإنتاجية العالية فحص لقياس السمسة من الخلايا T عندما حضنت مع الخلايا المستهدفة الورم. هذا الأسلوب يستخدم مجموعة كثيفة من اللدائن المرنة، من شبه نانولتر الآبار (آبار ~ 100،000 / مجموعة) لحصر الخلايا T مكانيا والخلايا المستهدفة في نسب محددة ويقترن إلى مضان المجهر لمراقبة المستجيب المستهدفة الاقتران وموت الخلايا المبرمج اللاحقة.
Abstract
يمكن علاج مناعي السرطان تسخير خصوصية الاستجابة المناعية لاستهداف والقضاء على الأورام. وقد أظهرت بالتبني العلاج بالخلايا (ACT) استنادا إلى نقل بالتبني من الخلايا T المعدلة وراثيا للتعبير عن مستقبلات مستضد خيالية (CAR) وعد كبير في التجارب السريرية 1-4. هناك العديد من المزايا لاستخدام الخلايا T + CAR لعلاج السرطان بما في ذلك القدرة على استهداف مستضدات غير مقيد MHC والخلايا T functionalize من أجل البقاء الأمثل، واستمرار صاروخ موجه داخل المضيف، وأخيرا للحث على موت الخلايا المبرمج للCAR + T الخلايا في حالة سمية المضيف 5.
ترسيم الوظائف الأمثل للخلايا T + CAR المرتبطة فائدة سريرية أمر ضروري لتصميم الجيل القادم من التجارب السريرية. التطورات الحديثة في مجال التصوير المجهري مثل الحيوانات الحية multiphoton أحدثت ثورة في دراسة وظيفة الخلايا المناعية طن فيفو 6،7. في حين أن هذه الدراسات تقدمت فهمنا للخلية T-ظائف في الجسم الحي، T-ACT خلية مقرها في التجارب السريرية يتطلب الحاجة إلى ربط الميزات الجزيئية والوظيفية للخلية T-الاستعدادات قبل التسريب مع الفعالية السريرية بعد التسريب، من خلال الاستفادة في المقايسات المختبر رصد الخلايا T-ظائف مثل إفراز خلوى السمسة و. وقد وضعت معيار التدفق الخلوي المقايسات تستند إلى تحديد الأداء العام للسكان من الخلايا T على مستوى وحيدة الخلية ولكن هذه ليست مناسبة لرصد وتشكيل المتقارن أعمار أو قدرة الخلية نفسها لقتل أهداف متعددة 8.
صفائف Microfabricated مصممة في مثل البوليمرات حيويا polydimethylsiloxane (PDMS) هي وسيلة جذابة بشكل خاص لحصر مكانيا المستجيبات والأهداف في حجم صغير 9. بالاشتراك مع المجهري مضان الآلي الوقت الفاصل بين، ثويمكن رصدها من usands المستجيب المستهدفة التفاعلات في وقت واحد من الآبار الفردية تصوير مجموعة nanowell. نقدم هنا منهجية عالية الإنتاجية لرصد الخلايا T-السمسة بوساطة على مستوى وحيدة الخلية التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة وظائف الخلايا T لحل الخلايا.
Protocol
1. الكواشف إعداد
- إعداد RPMI-PLGH عن طريق خلط 500 مل RPMI-1640 و 5 مل الستربتوميسين، كل من البنسلين، L-الجلوتامين، والحل HEPES.
- إعداد R10 حل عن طريق خلط RPMI-PLGH مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). وFBS المعطل للحرارة بنسبة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الإضافة.
- قبل الدافئة في 37 ° C 50 مل من RPMI-PLGH، 15 مل من برنامج تلفزيوني، و 15 مل من R10 في أنابيب مخروطية معقمة.
- وملفقة باستخدام السيليكون سيد ضوئيه أساسا كما هو موضح سابقا (10): تلفيق صفائف nanowells في PDMS. مزيج دقيق من عدة الاستومر Sylgard 184 قاعدة وكيل علاج في نسبة الوزن في فنجان 10:01 القابل للتصرف باستخدام سكين من البلاستيك. ديغا الخليط في فراغ الغرفة لمدة 1 ساعة. صب الخليط على مجموعة nanowell، ختم مع شريحة زجاجية والسماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة. نقل الجمعية إلى تعيين الفرن إلى 80 ° C لمدة 2 ساعة والسماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ستقوم الاستومر الحاليه خلال هذه الفترة والإرادة السندات إلى شريحة زجاجية. رفع بعناية شريحة زجاجية تحتوي على مجموعة من nanowell PDMS سيد السيليكون، مع تغطية لاصق شفاف وتخزينها حتى استخدامها في المستقبل.
2. الهدف الخليوي (T) وصفها
- عد الخلايا المستهدفة 5 ملايين من زراعة الخلايا باستخدام عدادة الكريات وبيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق. يتم تقسيم خلية ثقافة في اليوم السابق في حجم 5 مل الإجمالي (الكثافة = 1 مليون / مل) ومثقف في T-25 قارورة (VWR). وقد وصفت بروتوكولات لفرز الخلايا باستخدام عدادة الكريات بالتفصيل سابقا 11
- نضح وسائل الإعلام الزائدة تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
- إعداد الحل عمل خلية المقتفي الأحمر (CTR) عن طريق خلط 0،5 ميكرولتر الأسهم CTR (1 ملي) إلى 150 ميكرولتر RPMI-PLGH (تركيز النهائي 2.5 ميكرومتر). إضافة 150 ميكرولتر من محلول العمل إلى الخلايا المستهدفة ومزيج دقيق باستخدام ماصة P200.بالتناوب، يمكن استخدام PKH 26 (تركيز النهائي من 2 ميكرومتر) تسمية الخلايا المستهدفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة.
3. المستجيب وصفها الخليوي (E)
- عد الخلايا المستجيب 5000000 من زراعة الخلايا باستخدام عدادة الكريات وبيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام الزائدة
- إعداد الحل حل Vybrant عمل اللطخة DyeCycleViolet عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من 5 ملي الأسهم البنفسج Vybrant إلى 1 مل من وسائل الإعلام R10 (تركيز النهائي من 5 ميكرومتر). إضافة الحل تعمل على الخلايا و resuspend باستخدام ماصة P200. بالتناوب، يمكن استخدام PKH 67 (تركيز النهائي من 2 ميكرومتر) تسمية الخلايا المستهدفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إذا تم استخدام PKH 67، فإنه لا ينبغي أن تستخدم SYTOX الأخضر لأنها في نفس القناة مضان. ويتم تعداد أهداف أفكارك باستخدام حصرا AnnexinV تلطيخ في هذه الحالة.
ملاحظة: إذا يؤدون الوقت الفاصل بين نقطة النهاية وقياسات لا، وينبغي تجنب مثل الأصباغ UV البنفسج Vybrant. - احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة.
4. فصل الخلايا الحية والميتة باستخدام التدرج الكثافة
- إضافة 6.8 مل و 6.0 مل من RPMI-PLGH إلى الهدف والخلايا المستجيب على التوالي وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا بلطف.
- طبقة 3،5 مل من FICOLL-Plus لPaque أسفل كل أنبوب مخروطي يحتوي على الهدف والخلايا المستجيب. طبقة FICOLL ببطء لضمان تشكيل جيد للطبقات بين FICOLL وسائل الإعلام.
- أجهزة الطرد المركزي على حد سواء في 340 XG أنابيب لمدة 30 دقيقة. مع عدم وجود الفرامل والتسارع.
- خلال الطرد المركزي، ونقل 7 مل من قبل تحسنت PBS إلى لوحة 4-أيضا. إعداد مجموعة nanowell (ملفقة في PDMS): الجزء السفلي من شريحة زجاجية نظيفة مع الإيثانول وأكسدة PDMS في وضع RF عالية باستخدام البلازما مؤكسد لمدة 1 دقيقة. هذه الخطوة سوف مسكrilize مجموعة nanowell حين جعل أيضا PDMS ماء. نقل على الفور إلى مجموعة nanowell لوحة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- نقل لوحة إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ونضح PBS الزائدة. جعل 10 مل أجار النبيلة 1٪ بإضافة 100 ملغ مسحوق أجار إلى 10 مل ماء ثم DI الميكروويف لمدة 30-45 ثانية من. تطبيق الحارة أجار النبيلة 1٪ على الحافة العلوية والسفلية من الشرائح الزجاجية التي تحتوي على مجموعة nanowell لشل حركة مجموعة وانتظر 10 دقيقة لأجار لترسيخ. إضافة 3 مل PBS وأجار الزائدة الرشفة.
- إضافة 3 مل من R10 على الجزء العلوي من مجموعة nanowell والسماح لها لتتوازن 10 دقيقة ~.
- بعد الطرد المركزي FICOLL، نضح 5 مل من وسائل الاعلام الطبقة العليا من كل أنبوب. يجب الحرص على عدم نضح الطبقة التي تحتوي على الخلايا.
- حصاد الخلايا (الطبقة البيضاء) من خلال استعادة مل 1-2 من الطبقة بين FICOLL وسائل الإعلام مع P1، 000 ماصة والانتقال إلى أنابيب جديدة المخروطية العقيمة. كرر هذا لهاتين المجموعتين من الخلايا في حين التأكد من أن مكسيمإيزي الخلايا الانتعاش.
- أضف 3 مل من قبل تحسنت RPMI-PLGH إلى كل المزيج، بواسطة أنبوب pipetting وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق على تسريع كامل والفرامل.
- نضح وسائل الإعلام الزائدة، إضافة 5 مل من قبل تحسنت RPMI-PLGH لكل أنبوب الطرد المركزي وتكرار في 340 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام الزائدة و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من R10.
- عد الخلايا الحية باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات.
5. تحميل خلية على صفيف Nanowell
- نضح وسائل الإعلام الزائدة من مجموعة nanowell وإضافة 2 مل من R10 جديدة عبر الصفيف. نضح مرة أخرى مع التأكد من الجزء العلوي من مجموعة nanowell ليس رطبة جدا / الجافة لأنها سوف تؤثر على توزيع الخلايا.
- إيداع 1 × 10 5 خلايا المستجيب في 200 ميكرولتر من R10 على سطح مجموعة nanowell (الكثافة = 5 × 10 5 خلية / مل).
- اسمحوا الخلايا تسوية لمدة 5 دقائق وباستخدام زراعة الأنسجة معيار الاختيار المجهر لENالتأكد من أن توزيع الخلايا غير المرغوب فيه. إضافة المزيد من الخلايا إذا لزم الأمر.
- إيداع 1 × 10 خلايا الهدف 5 في 200 ميكرولتر R10 على سطح مجموعة nanowell (الكثافة = 5 × 10 5 خلية / مل).
- اسمحوا الخلايا تسوية لمدة 5 دقائق وباستخدام زراعة الأنسجة معيار الاختيار المجهر للتأكد من أن توزيع الخلايا غير المرغوب فيه. إضافة المزيد من الخلايا إذا لزم الأمر.
- شطف nanowell مجموعة بعناية مع 2 مل R10 وسائل الإعلام الزائدة الرشفة.
- إعداد 3 مل قبل تحسنت R10 في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة. إضافة 3 ميكرولتر من حمض النووي 0.5mM الأخضر SYTOX اللطخة (تركيز النهائي 0.5 ميكرومتر) و 60 ميكرولتر من Annexin V-اليكسا فلور 647 لإعداد حل العمل. إضافة الحل يعمل على طبق 4-بعناية جيدا مع التأكد من عدم نزوح الخلايا من الآبار.
- احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة.
6. التصوير 1
- الحصول على صور من الصفيف nanowell باستخدام ميكر مضانoscope: في هذا المثال، نستخدم المراقب ZEISS Z-1 المجهر مجهزة بمحرك مرحلة وامبدا DG4.
- تهيئة البرمجيات والمجهر وتحقق قوة إشارة على ضوء المنقولة وغيرها من القنوات الفلورسنت. وعموما، ستكون هناك خمس قنوات الموافق: الضوء المرسل، Annexin V-647 (Cy5 فلتر)، CTR (DsRed فلتر)، SYTOX الأخضر (FITC مرشح)، وVybrant البنفسج (دابي فلتر). تأكد من أن المجهر ذلك لضمان إعداد إشارة القصوى للضوضاء مع تجنب التشبع.
- تعيين X و Y لموقف مجموعة nanowell. تبدأ العملية من خلال تحديد موقف وتهيئة صفر التركيز على وسط 7 × 7 بلوك مجموعة nanowell على أعلى الزاوية اليسرى من الطابع مجموعة nanowell. تعيين، X Y مواقف ليتزامن مع مركز كل كتلة وذات قيمة Z لتعكس بدقة التركيز على كل كتلة.
- مرة واحدة في موقف والتركيز على كل مجموعة، للتأكد من الحصول على الصور في تحديد النظام الخطي والحصول على صور.
7. بعد التصوير
نقل لوحة 4-يحتوي على مجموعة جيدة nanowell في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2) لمدة 6 ساعة.
8. التصوير 2
الحصول على الصور في المرة الثانية نقطة كما هو موضح في الخطوة 6.
9. تحليل الصور
- يتم تحديد الخلايا الإشغال في nanowells عن طريق استخدام برامج مناسبة تجزئة الصورة (على سبيل المثال يماغيج، http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) أساسا كما هو موضح سابقا 9،12.
- ويستخدم لتوليد قاعدة بيانات من nanowells الفردية التي تحتوي على خلية واحدة بالضبط الهدف الحية (التي تم تحديدها؛ تحليل مجموعة أولية من الصور المجهر (T 0 ر = 0 ساعة)من CellTracker الأحمر؛ الأحمر) وليس الخلايا الميتة (التي حددتها تلطيخ V Annexin والأخضر) [T1t 0 nanowells].
- ويستخدم لتحديد قاعدة بيانات مستقلة الثاني من nanowells تحتوي على 1 الخلية المستهدفة (أحمر) [6 T1t nanowells]؛ تحليل المجموعة الثانية من الصور المجهر (ر 6 طن = 6 ساعة). ويتم تنفيذ التحقق من تكامل (استعلام قاعدة البيانات) لضمان مطابقة جميع الأهداف المباشرة في ر 0 إلى الأهداف عند ر 6 إلى وضع مجموعة من الأهداف النهائية المتطابقة (كما نفذت nanowells التي لديها T1t 0 = T1t 6، تسمى T1match)
- يتم تحديد عدد الخلايا المستجيب في nanowells باستخدام Vybrant تلطيخ البنفسج في ر 0 [E1 nanowells]
- ويتم تنفيذ استعلام قاعدة بيانات لتحديد nanowells التي تحتوي على واحد المستجيبات شارك في المحتضنة مع أهداف واحدة (كما هو محدد nanowells التي لديها مباراة وE1 T1، على النحو المحدد E1T1)
- وسجل المستجيب الخلايا الناجم عن ط dentifying الأهداف التي Annexin V السلبية في ر 0 و V Annexin إيجابية في تي 4 (E1T1 مع تلطيخ Annexin الهدف الخامس في ر 6).
10. اختياري الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام القتل من نيكون BioStation IM
- تأخذ طبق بيتري مع ساترة أسفل وقطع قطعة صغيرة من رقاقة مجموعة nanowell (أعدت في الخطوة 5) التي تناسب تماما على ساترة. تأكد من أن يبقى رقاقة الرطب بينما القطع.
- مزيج 1 × 10 6 أهداف و 1 × 10 6 خلايا T في 100 ميكرولتر وسائل الإعلام، وماصة وضعها على ساترة.
- السماح حوالي 15-30 دقيقة للسماح للخلايا تسوية.
- عكس بسرعة مجموعة صغيرة nanowell رقاقة ووضعه على ساترة.
- من أجل ضمان أن رقاقة لن تكون قادرة على التحرك خلال مكان، والتصوير واحد أو اثنين X 20MM 20MM coverslips على الجزء العلوي من الشريحة. الضغط برفق لدفع الشريحة إلى الجزء السفلي من الطبق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتجلى مثال على تطبيق الفحص عالية الإنتاجية لحل الخلايا في الشكل 2. لفترة وجيزة، وصفت CD19 محددة CAR + T والخلايا شارك في المحتضنة مع خلايا فأر المسمى الهدف EL4 في الآبار الفردية للمجموعة nanowell (الأقسام 1-5). تم تسجيل صورة أولية عن المجهر الفلورسنت الآلي لتحديد الإشغال (المستجيبات و / أو الأهداف) من كل واحد على nanowell مجموعة (القسم 6). كان يستخدم لمعالجة الصور التي تحتوي على تحديد جميع nanowells بالضبط هدف واحد واحد والمستجيب لاستبعاد nanowells تحتوي على أهداف الميت (القسم 9). تم نقل رقاقة لحاضنة لل6H ثم تم تسجيل الصورة الثانية من الشريحة (الأقسام 7-8). وتم قياس قدرة المستجيب للحث على موت الخلايا المبرمج في الخلايا المستهدفة من قبل تلطيخ مع V Annexin، في nanowells تحتوي على هدف واحد بالضبط المستجيب واحد. تم تشغيل تجربتين بالتوازي مع المستجيبات نفس ومجموعتين سالخلايا المستهدفة و (CD19 +-EL4 وEL4-CD19-(المراقبة السلبية)) لتحديد وتيرة مستضد محددة تحلل (الشكل 2). من المستحسن أن يتم تحقيق الترددات المنخفضة غير محددة تحلل (~ 2-4٪). منهجية تعتمد على توافر الخلايا المستهدفة المناسبة والتجارب الموازية تدار لتحديد أهداف في موت الخلايا المبرمج من المستجيبات مستقلة. الترددات العالية من موت الخلايا المبرمج الهدف في غياب المستجيبات خلال الفترة 6H (> 8٪) إلى الحاجة إلى تحسين ظروف زراعة والفحص. يمكن تكييفها لمجموعة nanowell الوقت الفاصل بين التصوير عند الحاجة الرصد المستمر (الفيلم 1) وهذا يسمح لمراقبة المستجيب المستهدفة اقتران واللاحقة خلية موت.
الشكل 1. A. تخطيطي للمقايسة nanowell مجموعة مقرها لحل الخلايا. صفتها CAR +خلايا T (الأزرق) والخلايا المستهدفة (أحمر) يتم تحضين في مجموعة من nanowells. ويستخدم المجهر لمراقبة انحلال خلوي المستجيب الهدف بوساطة. B. micrographs الممثل مركب من CD19 محددة CAR + T التي تحفز خلايا موت الخلايا المبرمج في EL4-CD19 + الخلايا المستهدفة وتلك التي لا تفعل ذلك.
الشكل 2. مستضد محددة لحل الخلايا من النشاط CD19 محددة CAR + الخلايا التائية. المؤامرات الخلية المستهدفة الرسم البياني من الآبار تحتوي على المستجيب واحد وهدف واحد بعد 6 ساعة من الحضانة المشتركة. وتظهر المدرج الاحصائي مطابقة للخلايا المستهدفة دون المستجيبات للإبلاغ عن تكرار موت الخلايا الخلفية.
الفيلم 1. والوقت الفاصل بين المجهري للCAR + T الخلية بوساطة انحلال خلوي. CAR + الخلايا T (الخالي من الملصقات) شارك في المحتضنة مع NALM-6-GFP الخلايا المستهدفة + (الأخضر) في NAواتخذت نويل والصور كل دقيقة 2 ليصبح المجموع 12 ساعة لتتمكن من متابعة ديناميكية. تمت إضافة Annexin V إلى وسائل الإعلام والثقافة تصبح خلايا المسمى أفكارك الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أوجزنا بروتوكول لفحص وحيدة الخلية الإنتاجية العالية عن طريق تمكين لحل الخلايا الحضانة المشتركة للالمستجيبات والأهداف في صفائف nanowells (الشكل 1). بالإضافة إلى الإنتاجية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على رصد المستجيب بوساطة السمسة ضد الخلايا الهدف المنشود دون الحاجة للهندسة الخلية المستهدفة والتي بدورها تسمح لاستخدام الخلايا السرطانية ذاتي أو المطابقة / الابتدائي والخلايا المستهدفة. الحبس المكاني يسمح للاسترجاع والاستنساخ اللاحقة من الخلايا T وظيفية في نهاية الفحص 9. وجود قيود على الفحص هو الحاجة إلى المجاهر المتخصصة مع مراحل الآلي والبصريات سريع التحول. لكن هذا ليس قيدا خطيرا نظرا لأن هذه الآلات متوفرة الآن على نطاق واسع كجزء من المرافق الأساسية البحثية.
وهناك مجموعة متنوعة من تدفق الخلوي المقايسات القائمة التي تقدم أعلى إنتاجية في حين preserviنانوغرام وحيدة الخلية القرار. وتشمل هذه المقايسات التي وصمة عار للعلامة بديلة للتحبب (CD107a) أو محتوى perforin في المستجيبات والنشاط كاسباس granzymes / 13،14 في الأهداف. هذه المقايسات ولكن لا حقا رصد المستجيب المستهدفة الاقتران أو قدرة المستجيب على المشاركة وقتل أهداف متعددة. مقارنة مقايسة معيار الذهب مثل مقايسة 51Cr الإفراج 4H، تشغيل في E: T نسب من 1:1، منهجيتنا تقارير عادة نفس العدد الإجمالي للالمستجيبات لحل الخلايا، في حين لا يزال توفير وحيدة الخلية القرار. على الرغم من أن يمكن بروتوكول المبينة هنا التفاصيل فقط على السمسة، على النحو المبين سابقا أن هذا الفحص جنبا إلى جنب مع الفحص بسهولة microengraving لتحديد السيتوكينات يفرز من قبل خلايا المستجيب واحدا عند ربط الهدف 9. بالتالي فمن الممكن توليد ملامح وظيفية مركب من خلايا T + CAR التي تجمع بين السمسة وإفراز خلوى على مستوى وحيدة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
أفادت الأبحاث في هذا المنشور كان مدعوما من المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة القومية تحت رقم R01CA174385 جائزة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
