Summary
一个基因操纵技术上皮细胞内全
Abstract
分支形态发生发展过程中的许多器官和胚胎小鼠颌下腺(SMG),是一个经典模型的研究分支形态。在发展中国家SMG,这个过程涉及迭代步骤的上皮芽管形成,最终上升到一个复杂的腺泡和导管,分支网络的服务产生和修改/运输唾液,分别进入口腔1 - 3。上皮相关的基底膜和间充质室,包括间充质细胞,生长因子和细胞外基质,由这些细胞产生的方面,分支机构是至关重要的,但如何协调细胞和分子事件仍然知之甚少4 。这项研究的分子机制驾驶上皮形态的进步,我们的发展机制的理解和洞察可能雷格纳积极行动的医学方法。这些研究的唾液腺上皮细胞进行遗传操作的有效方法由于缺乏而受到阻碍。目前,腺病毒转导针对成年腺体的上皮细胞在体内 5表示的最有效方法。然而,在胚胎外植体,致密的间充质细胞和上皮细胞周围的基底膜阻碍病毒获得的上皮细胞。如果间质被除去,被转染的上皮细胞可以使用腺病毒,和上皮雏形可以恢复分支形态存在的Matrigel或层粘连蛋白-111 6,7。间充质-上皮雏形的增长还需要额外的补充可溶性生长因子,并不能完全概括分支形态,因为它发生在完整的腺体8。在这里,我们描述了一种技术,这有利于腺病毒转导的上皮细胞和转染的电子文化pithelium相关的间充质。胚胎冲锋枪,去除间质,用含GFP-腺病毒感染的上皮细胞显微切割之后,我们显示,上皮细胞与未感染的间充质细胞自发重组,扼要完整SMG腺体结构和分支形态。使用标准的荧光显微镜方法,可以很容易地监控转基因上皮细胞人口,如果荧光标记的腺病毒结构。这里描述的组织重组方法是目前最有效的和可访问的方法,与野生型或突变型的矢量在一个复杂的三维组织结构,不需要产生转基因动物的上皮细胞的转染。
Protocol
该协议包含四个主要的步骤,在图1中所描绘的。所有步骤都全面详细的描述。腺病毒载体建设和病毒纯化,应提前进行的活体摘取器官在基因转导的解剖上皮细胞的雏形。所有BSL-2标准的安全防范措施时,应遵循工作的腺病毒。
1。小鼠胚胎颌下腺(SMG)收获和显微切割
- 安乐死定时的怀孕雌性小鼠(封闭群CD-1或ICR)使用CO 2昏迷状态,其次是颈椎错位和收获字符串的小鼠胚胎在胚胎13天(E13,3-5上皮芽)以下程序批准的机构IACUC委员会。阴道塞发现这一天被指定为E0。在E12阶段时,有一个单独的主芽和茎裂刚刚开始,唾液腺也有所收获,并培养启动。冲锋枪在此之前的阶段需要不同的培养条件下比在此间表示。
- 转移胚胎字符串到无菌的10厘米组织文化的菜肴装有25毫升的DMEM /火腿的F12中(F12)无酚红(Life Technologies公司),辅以100ü/ ml青霉素,和100微克/毫升链霉素(笔,链球菌, Life Technologies公司)。
- 用无菌手术刀(11片扇叶),镊子(#5,精细的科学工具,11252-20),从囊中取出胚胎成一个独立的10厘米菜含有25毫升的DMEM/F12 +笔链球菌。
- SEVER的的胚胎头与下颚的正下方有角度的切割。
- 下一个立体解剖显微镜与透射光底座(尼康SMZ645或同等学历)使用切割低于上颌骨,下颌骨的头低隔离。将顶部的一个额外的一块玻璃上,而不是直接在显微镜基础的玻璃成分的组织。
- 收集下颌骨3毫升DMEM/F12 +笔链球菌在无菌的35 mm组织培养皿中。
- 一个颚切片放置在解剖显微镜载物台上,使舌是切片的底部上,但指向12:00点钟位置。
- 使用两个交叉钳在剪运动的一面,删除和丢弃的下1/3 路的下颌骨片。
- 将片90°的右侧(右手),使用的钳子剪切一半切片,切下颌骨片的顶部(不切割的舌头)。
- 剥离多余的组织,并删除它,露出下面的冲锋枪。会有一个舌根附近的每一侧上。
- 用一个钳子按住组织的舌头,使用产钳的舌头挑逗SMG距离。重复的其他腺体。
- 到一个新的无菌35mm组织分为3毫升的DMEM/F12 +笔-链球菌收藏报错显微切割的唾液腺培养皿中。注:较大的颌下腺(3-5上皮芽)与关连较小的舌下腺(1芽)是可以培养的完整跳过步骤4和执行步骤4.1,4.3,4.4,如前所述,2,8。
2。 SMG上皮萌芽分离
- 地点5(或更多)唾液腺腺体到玻璃底部的,50毫米直径微孔培养皿(MatTek公司,P50G-1.5-14-F)含有200微升的Hank氏平衡盐溶液(HBSS中缺乏钙+ +或镁+ +, Life Technologies公司),含有0.4%(体积/体积)分散酶(Life Technologies公司,目录号17105-041),并孵育15分钟,在37℃下
- 温育后,用200μl的无菌移液管尖,小心吸出分散酶溶液,而不会干扰腺体。立即加入200微升的DMEM/F12培养基含有5%(重量/体积)BSA(DMEM/F12-BSA用0.22μm的过滤器,预先灭菌的),以中和分离酶。 <李在解剖显微镜下,用钳子细提示(#5 Dumostar,精细的科学工具,11295-20),轻轻分开松动的间充质细胞各地SMG上皮芽和管道,照顾离开上皮细胞的完整性。
- 预湿的无菌200微升移液器吸头与DMEM/F12-BSA媒体,轻轻移液管的上皮细胞到一个新的50毫米直径的微孔菜含有200μl的DMEM/F12 +笔链球菌的雏形。使用高品质的200微升移液器吸头与平滑的边缘。
- 在菜含有间质片,丢弃任何非间充质组织的舌下腺和颌下腺任何分离的芽。
3。腺病毒感染的上皮雏形
- 200微升稀释在DMEM/F12 +笔链球菌在一个离心管中,使所得到的溶液的滴度为1×10 8 -10 9 PFU就能景点的腺病毒的病毒感染的媒体。 “不同的病毒所需的最佳的效价可能会有所不同。重要的是要使用氯化铯(CsCl)纯化的病毒制剂的最佳吸收效率。
- 从盘子里取出媒体包含5个上皮细胞的雏形。快速加入200μl的感染媒介,在任何时候都保持潮湿的雏形。采取必要的预防措施,在处理病毒和处置受污染的枪头。 10%的漂白粉溶液消毒任何被病毒污染的表面。
- 将上皮细胞的雏形远从彼此用钳子夹,以防止它们粘在一起,使他们能够解决的盘底。在病毒性媒体,在室温下的1小时的孵育雏形。在培育,分离的雏形,如果他们靠拢在一起。过度摇摆或运动将使腺体聚集在一起。
- 培养结束后,温和地去除病毒的媒体和丢弃适当,小心不要破坏了Rudiments。加入200μlDMEM/F12 +笔链球菌。重复此清洗至少两次,并更换200μl的DMEM/F12 +笔链球菌媒体。这些洗是关键,以消除任何病毒,不连接的上皮和间质,以防止感染。
- 孵育上皮雏形与200毫升的DMEM/F12中含有2%(体积/体积)的基质胶(BD Biosciences公司,356231)20分钟。我们发现,这在Matrigel的潜伏期短,最大限度地减少了现有裂在最初的文化回归,但这个步骤缺一不可,如果不希望暴露在Matrigel的。
(4) 体外培养重组冲锋枪
- 放置每个雏形,一次一个地,使用预湿的200μl的移液管尖,在顶部的切口(小切口)13毫米,0.1微米核孔履带蚀刻膜过滤器(Whatman)超过200μl的培养基(漂浮入门/过滤器)在玻璃底的微孔板。文化传媒是:含有50微克/毫升转铁蛋白和150微克/毫升的抗坏血酸,如前所述2,8的DMEM/F12 +笔-链球菌。转铁蛋白是众所周知的刺激的生存和分支的唾液腺等器官外植体的形态发生9。添加抗坏血酸已证明刺激SMG分支。10是已知的作为一个辅助因子在许多羟化反应的代谢途径(如脯氨酸羟化胶原纤维形成11期间),也刺激其他器官的外植体中的纤连蛋白和层粘连蛋白的生产12。
- 后移除尽可能多的媒体之上的过滤器尽可能增加每个上皮雏形。太多媒体的过滤器上,可能会导致过滤器下沉,而较少的媒体位置的雏形和间充质更容易。可以去除多余的介质,使用了一套吸头或用钳子夹住媒体之间的技巧。
- 地点间充质件的来回米3至4个腺体的顶部和/或围绕每个上皮雏形。删除任何额外的介质,周围的腺体,间质,以避免运动距离的雏形。间充质来自更腺体的是没有好处的,但不太可能会损害上皮雏形增长。
- 孵育重组冲锋枪可增湿培养箱中(95%空气/ 5%CO 2)在37℃下为48 -72小时,根据需要。
- 收购明场和/或荧光图像的活腺体0小时(如果需要),重组后2小时,每24小时后倒置,直立,或立体光学显微镜配备了一台数码相机使用了4倍或5倍放大倍率的目标是在一个单一的框架来看,捕捉整个重组腺。唾液腺的图像显示使用明场设置或适当的相环的光路(上完全自动化的显微镜,这是不可能的)部分进入最佳的对比度。标准相差不吨必要的,因为腺体很厚,产生的对比。
- 在期望的时间点可以是固定的20分钟制成的2%多聚甲醛(PFA)的1X PBS中含有5%(重量/体积)蔗糖(从而更好地保持的保持的细胞在细胞内部结构与固定液,重组冲锋枪等渗状态)。不同于4%PFA,2%PFA将维持一个显着量的GFP信号,如果固定剂固定后完全除去。腺体,可存储长达1周1X PBS在黑暗中,在4°C,直到整个安装进行免疫细胞化学和激光共聚焦成像,如先前报道3,6,13-15。理想的情况下,免疫细胞化学和成像应尽快进行固定后,以获得最佳的图像质量。腺体也可以在RIPA缓冲液中溶解,然后通过Western印迹法分析进行SDS-PAGE。
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Representative Results
流动的主要的实验步骤在图1中概述。在图2中所示的一个例子的一个完整的SMG,一个孤立的上皮雏形,和其相应的间充质细胞。固定和成像的明视场图像重组冲锋枪,继续进行培养体外时的指定的时间,在图3中所示的分支形态,生长48小时表达上皮的GFP的图4中所示的重组质粒腺体的重组冲锋枪的共聚焦图像随后通过免疫细胞化学的72小时培养后, 如图5中所示。 E-钙粘蛋白,上皮细胞标志,划定上皮细胞表达GFP的人口从周围的间充质。基底膜蛋白,串珠素,定位于上皮细胞的外周的检测表明至少部分重组重组腺体的基底膜。FIGURE 6。副交感神经颌下神经节进行神经轴突生长和神经支配的腺体重组文化,如19
图1(A),流程图和(B)示意图描绘了主要的实验步骤。
图2(A)整个胚胎13天(E13)唾液腺周围的间充质细胞(MES)的舌下腺上皮细胞(SL EPI)和颌下腺上皮细胞(SMG EPI)的明场图像。 (B)隔离上皮的萌芽,和(C)分离间充质。比例尺= 100微米。
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图3。上皮的雏形(见白色虚线)的明场图像所包围指定的时间生长在体外培养的间充质件。上皮细胞进行分支形态发生和间充质冷凝是显而易见的,因为早在培养24小时。比例尺= 100微米
图4。明视场(A),荧光(B)和重叠的(C)的图像,其中只有被感染的上皮细胞(白色虚线概述)与表达GFP的腺病毒和培养48小时的体外重组冲锋枪。比例尺= 100微米。
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图5。标示有(A)的核(DAPI,蓝),腺病毒GFP(绿色),上皮标记重组冲锋枪的共聚焦图像或明场图像(BF)。 E-钙粘蛋白(红色),比例尺= 250微米,或(B)核(DAPI,蓝),腺GFP(绿色),上皮细胞标志,E-钙粘蛋白(红色),与基底膜标记,串珠素(青色),比例尺= 50微米。白色虚线的线条勾勒上皮细胞。 点击此处查看大图 。
图6。副交感神经颌下神经节进行神经轴突生长和支配腺体重组文化,比例尺= 250微米。
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Discussion
上皮-间质体外重组技术首次公布于1981年16颌下唾液腺。在这个协议中,我们扩大后,原来的方法,使用腺病毒感染的操作范围内的重组腺上皮细胞基因的表达。我们表明,与腺病毒感染的上皮细胞的百分比,而被感染的细胞的百分比取决于病毒启动子的性质,病毒滴度,和病毒纯度。我们已经发现,有必要使用CsCl梯度纯化的高效上皮细胞转导,其中不在这里描述的纯化的病毒。既然我们也能够感染的间充质细胞的重组(数据未示出)之前,人口的间充质的独立的遗传操作也是可能的。最近,我们用这种腺病毒转染/组织重组的方法来识别的作用极性蛋白,PAR-1B中控制的发展唾液腺上皮基底膜的位置。死激酶的PAR-1B腺病毒和野生型PAR-1B腺病毒均在这项研究中13感染上皮细胞的雏形,并,重组与E13 mesenchymes。能够使用突变病毒询问特定的分子的功能,极大地提高了该方法的效用。
目前尚缺乏有效的工具是针对特定的分子内的在完整胚胎唾液腺中的上皮细胞人口没有影响骨髓间充质仓。虽然多项研究使用操作完整的器官培养中的信号转导的药理学抑制剂,这些抑制剂影响的上皮细胞和间充质。直接评估抑制剂上的上皮细胞的影响,上皮雏形必须在间充质细胞的情况下进行培养,在任一基底膜òŕ层粘连蛋白-111凝胶6,7。小抑制RNA的(siRNAs)的向下调节上皮基因表达以来的siRNA被优先占用由上皮细胞的存在下,大多数脂质载体13,14,17,18是一种有效的方法。然而,无论是用于干扰蛋白水平或功能的这些方法允许一个野生型或突变基因的过度表达。在胚胎整个SMG文化的传统(非病毒)的转染了有限的成功尝试,可以有针对性的,只有少量的上皮细胞(ML,未发表的数据)。比较,腺病毒转导表示专门转染唾液腺上皮细胞的一个有效的方法。
副交感神经最近已被证明是至关重要的正常涎腺分支维持角蛋白5阳性祖细胞群体19。此组织重组方法的信息的一个优点enchyme - 自由上皮的雏形培养方法是可维持在重组培养系统中的副交感神经节。的保持仔细跟踪的副交感神经节的大致位置,它位于相邻的原发性上皮管道19中的间充质细胞,它是可能的,以确保每个雏形结束被与神经节。然而,我们发现,结合3-4的的腺体价值mesenchymes每上皮雏形,足以支配芽在一定程度上( 图6)神经节与每一个雏形,但并不总是一样完整的未修改腺体。
有感染的上下文中的完整的腺上皮的替代方法。我们以前报道,显微注射法可以用于引入在完整的腺体20,21到上皮细胞的腺病毒。然而,显微注射法是难以CONTR醇,可以物理损坏的腺体,并且通常会导致感染的单元20的子集只有一个本地化。腺相关病毒(AAV)已被证明是有用的用于转染不同的细胞群的范围内的完整SMG器官外植体22。血清型scAAV2被证明是基本上在特定转导的上皮细胞的完整冲锋枪超过其他重组AAV载体23更高效。由于自动增值服务是没有被广泛市售,也不专长准备AAV存在在大多数实验室,腺病毒转导和组织重组协议这里提供的是更一般访问比大多数实验室使用AAV载体的。
虽然此组织重组方法概括上皮 - 间充质相互作用在一定程度上,它也可以用腺病毒感染的上皮细胞,然后长出上皮细胞以外的其本机上下文。正如前面所提到的,我们用腺病毒感染了完整的唾液腺上皮雏形,然后外加生长因子17,20,21增长的文化在基底膜。唾液的腺体器官外植体,也可以培养纳米纤维支架,这些支架虽然没有概括全功能的间充质细胞在其目前的形式15。虽然这些方法概括了本地的间充质都没有,这样的方法可以模仿的间充质细胞在体外培养的特定属性。
每个体外培养方法都有自己的优点和缺点,但适用于解决具体的科学问题。虽然重组的腺体不接受作为多分支形态做完整的唾液腺器官外植体,器官外植体,在一般的,概括在体内的分支形态发生了几天。这个问题的解决方案当然是来创造吃了含有目标基因表达的转基因动物的上皮车厢内。由于是已知的启动子被激活,特别是在早期发展SMG上皮,更昂贵的比所描述的方法和转基因技术仍然缺乏,组织重组实验中构成一个可行的模型系统,研究上皮细胞和间充质细胞信号早在其组织范围内的唾液腺细胞。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢迪尔德丽·尼尔森博士的有益的意见和批评性阅读的手稿。这项工作是由美国国立卫生研究院拨款DE019244,DE019197,和DE021841 ML,F32DE02098001圣雅各福群会,和C06 RR015464大学奥尔巴尼分校,纽约州立大学。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. |
References
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