Summary
형질 전환 마우스 또는 바이러스 성 벡터는 폐 내의 단백질 발현을 증가하는 데 사용되었습니다. 그러나이 기술은 기술적으로 도전적인 시간이 소요하고 결과를 혼동 할 수 있습니다 떨어져 표적 장기에 주요 영향이있다. 우리의 단백질 형질 프로토콜은 지질 기반의 transfection 시약 및 균일 폐 세포에 활성 단백질을 제공하는 초 미세 microsprayer을 사용합니다.
Abstract
단백질 발현을 증가하는 것은 연구자가 더 중요한 생물 학적 과정 1 조절에 그 단백질의 기능 역할을 이해 할 수 있습니다. 폐에서이 유전자 발현을 증가 4를 통해 단백질 수준을 상승 형질 전환 생쥐 2,3 또는 바이러스 성 또는 비 바이러스 성 벡터를 활용 유전 방식을 통해 일반적으로 달성되었다. 형질 전환 생쥐를 생성하는 비용과 시간이 많이 소요하고 유전자 또는 만성 유전자 발현의 임의 삽입은 정상 폐 발달을 변경하고 따라서 모델 5의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 조건식을 생성하는 데 사용되는 만성 유전자 발현 6, 반대 테트라 사이클린 제어 transactivator (rtTA) 마우스와 관련된 문제 AVERT 조건부 형질 전환은 자연 공기 공간 확대 7을 개발하면서. 형질 전환과 마찬가지로, 바이러스 성 및 비 바이러스 성 벡터의 사용은 8 비싸고 용량-D를 자극 할 수그 ependent 염증 반응 결과 9 혼란과 표현 10을 방해. 또한, 반복 투여의 효능은 벡터 11,12 향상 면역 반응에 의해 제한됩니다. 연구진은 적은 염증을 유발하고 폐 13에서 더 이상 표현이 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터를 개발하고 있습니다.
β-갈 락토시다 아제를 사용하여, 우리는 직접 단백질 형질 전환 기술을 사용하여 폐 내에서 신속하고 효율적으로 증가하는 단백질 발현을위한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 폐 조직 자체에 침투를 허용하는 지질 기반 형질 시약 20 μL (프로 피사체, 피어스 바이오)와 단백질을 정제 고정 된 금액을 섞는다. 리포좀 단백질 혼합물은 microsprayer (펜 세기, 필라델피아, PA)를 사용하여 기관을 통해 생쥐의 폐에 주입된다. microsprayer은 폐를 통해 액체 에어로졸의 벌금 깃털을 생성합니다. 기술을 사용하여우리는기도와 마우스 (14)의 폐포에 걸쳐 주입 단백질의 균일 한 증착을 증명하고있다. 지질 형질 전환 기술은 효과를 달성하기 위해 단백질의 소량 사용할 수 있습니다. 이 그렇지 않은 고단백 관리에 의해 자극 될 것이다 염증 반응을 제한합니다. 사실,이 기술 사용하여 우리는 우리가 크게 폐 세척 세포질 15에 영향을주지 않고 폐에 PP2A 활동을 증가시킬 수 있다고 발표했다. 공격 후 24 시간을 촬영 한 폐 세척의 세포질은 컨트롤에 비교했다 (27 ± 31 대 4 제어 ± 5 알부민, 형질 전환, N 그룹 당 = 6). 또한, 형질 전환 모델에서 발생할 수있는 폐 발달 변경이나 아키텍처 변경을 유도하지 않고 단백질 수준을 증가시킵니다. 그러나 반복 투여의 필요성 단백질 발현에 장기적인 증가의 효과를 조사 연구를위한이 기술은 불리한 만들 수 있습니다. 특히 트루 것짧은 반감기를 가진 단백질에 대한 전자.
Protocol
1. 단백질 형질 시약의 준비
- 드라이 필름을 포함하는 튜브에 메탄올 또는 클로로포름 250 μL를 추가하여 프로 피사체 시약을 녹인다.
- 최고 속도로 20 초 동안 소용돌이.
- 별도의 microcentrifuge 튜브에 프로 피사체 시약의 피펫 20 μL.
- 실온에서 6 시간의 최소 층류 후드 아래 프로 피사체 시약을 포함하는의 microcentrifuge 튜브를 배치하여 용매를 증발. 그것은 완전히 건조해야합니다. 또한, 진공 건조기를 사용하여 프로 피사체 시약을 건조.
- -20 ° C.에 튜브를 저장 그들은이 온도에서 일년 좋다.
2. 프로 피사체 시약에 단백질을 추가
- 건조 프로 피사체의 형질 시약 20 μL를 포함하는 관으로, 관심의 단백질 2.0 μg을 함유 PBS의 피펫 50 μL.
- 단백질을 추가 한 후, 저속 F에서 소용돌이로 교반하여 용액을 혼합또는 3-5 초 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음.
3. 단백질의 기관지 관리
- 케타민을 / xylazine의 복강 내 주사 (100 ㎎ / ㎏, 10 ㎎ / ㎏)로 마우스를 마취.
- 진정 작용이 달성 된 후, 마우스는 특별히 디자인 된 플랫폼 (그림 1)를 사용하여 상단 incisors에서 일시 중단됩니다.
- 집게와 후두경으로 종이 클립 사용, 구강 인두는 카테터 (그림 2) 도입 할 수 있도록 열립니다. 성대는 마우스의 기관에 광원을 배치하여 시각입니다.
- 단백질 / 프로젝트 시약 혼합물 (50 μL)는 펜 세기 Microsprayer을 사용하여 기관을 통해 주입된다.
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Representative Results
우리의 기술의 효과를 입증하기 위해 우리는 프로 피사체의 형질 시약 20 μL를 포함 PBS의 50 μL에 녹인 마우스 2 μg 알부민 (시그마)와 생쥐의기도를 주입하는 microsprayer (펜 세기)를 사용 하였다. 알부민 치료 마우스는 베타 - 갈 락토시다 아제 단백질의 2 μg (피어스 바이오)와 동일한 방법으로 처리 하였다 생쥐와 비교 하였다. 이십사시간 후, 마우스는 안락사되었고 폐 조직 학적 분석을 위해 처리되었습니다. 베타 - 갈 락토시다 아제에 대한 면역 조직 화학 염색은 알부민과 베타 - 갈 락토시다 아제 처리 생쥐 포르말린에 고정 된 폐 조직 섹션에 실시되었다. 심지어 24 시간 단백질 형질 전환 후에, 우리는 베타 - 갈 락토시다 취급 생쥐의기도에서 강한 염색 (큰 화살표)을 발견하지만 알부민 치료 생쥐 (그림 3A 및 3B).
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그림 1. 기관지 주입 마우스의 위치를, 나무 플랫폼의 기본 16에서 45 ° 각도로 경사를 가지고 건설되었다. 생쥐의 상단에있는 두 개의 금속 고리에 연결된 금속 와이어에 의해 자신의 앞니에서 일시 중단됩니다 램프. 혀를 부드럽게 집게와 종이 클립 후두경은기도를 여는 데 사용되는로 재배치된다.
그림 2. 목에 광원을 배치 한 후, 후두 기관지 주입 16 시각화 할 수 있습니다.
그림 3. β-갈 락토시다 immunostains은 2 μg과 intratracheally 주입 생쥐에서 4 μm의 폐 구간에서 실시되었다알부민 (A) 또는 β-갈 락토시다 제 (B). 화살표는기도 내 β-갈 락토시다 아제 염색을 나타냅니다. 이미지는 40X 배율에 있습니다. 스케일 바는 = 100 μm의.
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Discussion
다른 방법에 비해이 기술의 장점은 폐 조직 자체 내에서 단백질 수준과 활동의 증가를 생성하는 것입니다. 또한, 그것은 단지기도 내에 체류 반대로 폐의 가장 말단 지역에 침투합니다. 우리는 심지어 생리 식염수 15기도 lavaging 후 injectate 증가 단백질의 활동을 측정했다. 조직 활동 분석은 단백질이 세포를 입력하고 단지 마우스의 공기 공간에 남아 있지 않는 것을 나타냅니다. 이 또한 마우스의 폐포와기도 (그림 3)에서 우리의 주입 단백질의 확산 염색법을 보여 면역에 의해 확인되었다. 중요한 것은,이 프로토콜은 폐 염증이나 단백질 분해 효소의 발현을 자극하지 않습니다. 따라서, 발생 할 모든 변경 관리 단백질의 효과를 관찰 작용 할 수 있습니다. 염증 반응의 부족은 조마에 영향을 조사하기 위해 반복 주사의 사용을 허용시간의 연구 기간.
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Disclosures
저자는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (7R01HL098528-03)와 FAMRI의 임상 혁신 상 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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