Protein Transfektion av Mouse Lung

Summary

Transgena möss eller virala vektorer har använts för att öka proteinexpression inom lungan. Emellertid är dessa tekniker tidskrävande, tekniskt krävande och har ej åsyftade effekter som kan förbrylla resultat. Vår protein transfektion protokollet använder en lipidbaserad transfektionsreagens och ultrafina microsprayer att likformigt leverera aktivt protein till lungceller.

Abstract

Ökad protein expression möjliggör forskare att bättre förstå den funktionella rollen av detta protein i regleringen av viktiga biologiska processer ^1. I lungan, har detta uppnåtts vanligtvis genom genetiska metoder som utnyttjar transgena möss ^2,3 eller virala eller icke-virala vektorer som höjer proteinnivåer genom ökat genuttryck ^4. Transgena möss är kostsamma och tidskrävande att generera och den slumpmässiga insättning av en transgen eller kronisk genuttryck kan förändra normal lunga utveckling och därmed begränsa användbarheten av modellen ^5. Medan villkorliga transgena undvika problem associerade med kronisk genuttryck ^6, de omvända tetracyklin-kontrollerade transaktiverande (rtTA)-möss, vilka används för att generera villkorligt uttryck, utveckla spontan utvidgningen luftutrymme ^7. Som med transgena, är användningen av virala och icke-virala vektorer dyra ⁸ och kan framkalla dos-dependent inflammatoriska reaktioner som förbrylla resultat ⁹ och hindra yttrandefrihet ^10. Dessutom är effekten av upprepade doser begränsas av förbättrade immunsvar mot vektorn ^11,12. Forskare utvecklar adenoassocierade virala (AAV) vektorer som framkallar mindre inflammation och har längre uttryck inom lungan ^13.

Använda β-galaktosidas, presenterar vi en metod för att snabbt och effektivt öka proteinuttryck i lungorna med hjälp av en direkt metod protein transfektion. Detta protokoll blandar ett fast belopp på renat protein med 20 pl en lipidbaserad transfektionsreagens (Pro-Ject, Pierce Bio) för att möjliggöra inträngning i lungvävnaden själv. Den liposomala proteinblandningen injiceras sedan in i lungorna hos mössen via luftstrupen med användning av en microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). Den microsprayer genererar en fin plym av flytande aerosol hela lungorna. Användning av den teknikVi har visat jämn avsättning av den injicerade proteinet hela luftvägarna och alveolerna av möss ^14. Lipiden transfektion teknik medger användning av en liten mängd protein för att uppnå effekt. Detta begränsar den inflammatoriska reaktion som annars skulle framkallas av hög proteinhalt administration. I själva verket, med hjälp av denna teknik har vi publicerat att vi kunde avsevärt öka PP2A aktiviteten i lungan utan att påverka lungsköljning cellularitet ^15. Lungsköljning cellulariteten tagen 24 timmar efter utmaningen var jämförbar med kontroller (27 ± 4 styrning kontra 31 ± 5 albumin transfekterat, N = 6 per grupp). Dessutom ökar det protein nivåer utan att inducera lung utvecklingsmässiga förändringar eller arkitektoniska förändringar som kan uppstå i transgena modeller. Däremot kan behovet av upprepade administrationer göra denna teknik mindre gynnsamma för studier som undersökt effekterna av långsiktiga ökningar av proteinuttryck. Detta skulle vara särskilt true för proteiner med korta halveringstider.

Protocol

Ett. Framställning av Protein transfektionsreagens

1. Lös Pro-Ject reagens genom att tillsätta 250 ul metanol eller kloroform till röret med den torra filmen.
2. Vortex för 10-20 sekunder vid högsta hastighet.
3. Pipettera 20 pl Pro-Ject reagens i separata mikrocentrifugrör.
4. Indunsta lösningsmedlet genom att placera mikrocentrifugrör innehållande Pro-Ject Reagent under ett dragskåp med laminärt flöde under minst 6 h vid rumstemperatur. Det måste vara helt torr. Alternativt, torka Pro-Ject reagens med en vakuumexsickator.
5. Förvara rören vid -20 ° C. De är bra för ett år vid denna temperatur.

2. Lägga Protein till Pro-Ject Reagens

1. Pipettera 50 | il PBS, innehållande 2,0 | ig av proteinet av intresse, i ett rör innehållande 20 | il av torkad Pro-Ject transfektionsreagens.
2. Efter tillsats av protein, blanda lösningen genom vortex vid låg hastighet feller 3-5 sek följt av inkubering under 30 min vid rumstemperatur.

Tre. Intratrakeal Administration av protein

1. Söva möss genom intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin (100 mg / kg och 10 mg / kg).
2. Efter sedering uppnås, möss suspenderade från sina övre framtänder med en specialdesignad plattform (Figur 1).
3. Använd pincett och ett gem som ett laryngoskop, är orofarynx öppnas så att katetern kan införas (Figur 2). Stämbanden visualiseras genom att placera en ljuskälla mot luftstrupen av musen.
4. Proteinet / Projekt reagensblandning (50 pl) injiceras genom luftstrupen med en Penn Century Microsprayer.

Representative Results

För att demonstrera effektiviteten av vår teknik använde vi en microsprayer (Penn Century) att injicera luftstrupen av möss med 2 | ig av mus serumalbumin (Sigma) löst i 50 | il PBS som innehöll 20 | il av Pro-Ject transfektionsreagens. De albumin behandlade möss jämfördes med möss som behandlades på ett identiskt sätt med 2 ^ g av beta-galaktosidas-protein (Pierce Bio). Efter tjugofyra timmar, mössen avlivades och lungorna bearbetades för histologisk analys. Immunohistokemi för beta-galaktosidas utfördes på formalinfixerade sektioner lungvävnad från de behandlade albumin och beta-galaktosidas möss. Även 24 h efter protein transfektion detekterades vi intensiv färgning inuti luftvägarna (stora pilar) av de behandlade beta-galaktosidas-möss men inte de albumin behandlade möss (Figur 3A och 3B).

_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Figur 1. För att placera mössen för intratrakeal injektionen togs en ​​trä plattform konstrueras som har en ramp vid en 45 ° vinkel från sin bas ^16. Mössen är upphängda från sina framtänder av en metalltråd som är ansluten till två metall krokar på toppen av rampen. Tungan är försiktigt flyttas med pincett och gem laryngoskop används för att öppna luftvägarna.

Figur 2. Efter att ha placerat en ljuskälla på halsen, kan struphuvudet visualiseras för intratrakeal injektion ^16.

Figur 3. β-galaktosidas immunostains utfördes på 4-ìm lungsektioner från möss som injicerats intratrakealt med 2 pgalbumin (A) eller β-galaktosidas (B). Pilarna visar β-galaktosidas färgning inuti luftvägarna. Bilder finns på 40X förstoring. Skala bar = 100 nm.

Discussion

Fördelen med denna teknik jämfört med andra metoder är att den producerar ökningar i proteinnivåer och aktivitet inom lungvävnad själv. Dessutom tränger det till de mest distala regionerna i lungan i stället för att stanna bara i luftvägarna. Vi har uppmätt ökad protein aktiviteten av vår injektat även efter lavaging luftvägarna med koksaltlösning ^15. Tissue aktivitet analyser indikerar att proteinet in celler och inte bara kvar i luftspalter om musen. Detta bekräftades ytterligare genom immunhistokemi visar diffus färgning av vår injicerade proteiner inom alveolerna och luftvägar av mus (figur 3). Viktigt inte provocera detta protokoll inte lunginflammation eller proteas uttryck. Därmed kan eventuella förändringar som inträffar tillskrivas effekterna av den administrerade proteinet. Avsaknaden av inflammatorisk respons möjliggör användning av upprepade injektioner för att undersöka effekterna över en longer tidsperiod.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Microsprayer	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidase	Pierce Bio	89850
Beta-galactosidase antibody	Santa Cruz Bio	SC-19119
Mouse serum albumin	Sigma Aldrich	A3139
Ketamine/xylazine	Sigma Aldrich	K113