Summary
Os ratinhos transgénicos ou vectores virais têm sido utilizados para aumentar a expressão de proteína dentro do pulmão. No entanto, estas técnicas são demoradas e tecnicamente desafiante e têm efeitos fora do alvo, que pode confundir os resultados. O protocolo de transfecção de proteínas utiliza um reagente de transfecção à base de lipidos e uma microsprayer ultrafina para entregar uniformemente proteína activa a células do pulmão.
Abstract
O aumento da expressão da proteína permite aos pesquisadores entender melhor o papel funcional desta proteína na regulação de processos biológicos fundamentais 1. No pulmão, isto foi conseguido tipicamente através de abordagens genéticas que utilizam ratinhos transgénicos 2,3 ou vectores virais ou não virais, que elevam os níveis de proteínas por meio de aumento da expressão do gene 4. Os ratinhos transgénicos são dispendiosas e demoradas para a geração e a inserção aleatória de um gene de expressão do transgene ou crónica pode alterar o desenvolvimento normal dos pulmões e, portanto, limitar a utilidade do modelo de cinco. Enquanto transgénicos condicionais evitam os problemas associados com a expressão do gene crónica 6, os transactivador (rtTA) tetraciclina ratinhos controlados reversa, que são utilizados para gerar a expressão condicional, desenvolver espontânea alargamento espaço de ar 7. Tal como acontece com transgénicos, a utilização de vectores virais e não virais é caro 8 e pode provocar a dose drespostas inflamatórias ependent que confundem os resultados 9 e dificultar a expressão 10. Além disso, a eficácia de doses repetidas são limitados por respostas imunes reforçadas ao vetor de 11,12. Pesquisadores estão desenvolvendo adeno-associado vetores virais (AAV) que provocam menos inflamação e têm mais expressão dentro do pulmão 13.
Usando β-galactosidase, apresentamos um processo para o aumento da expressão de proteínas rápida e eficazmente dentro do pulmão, usando uma técnica de transfecção directa de proteínas. Este protocolo de mistura uma quantidade fixa de proteína purificada com 20 ul de um reagente de transfecção à base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir a penetração no próprio tecido do pulmão. A mistura de proteína lipossomal é então injectado para dentro dos pulmões dos ratos através da traqueia usando uma microsprayer (Penn Century, Filadélfia, PA). O microsprayer gera uma multa nuvem de aerossol líquido ao longo dos pulmões. Usando a técnicademonstrámos deposição uniforme da proteína injectada ao longo das vias aéreas e alvéolos dos ratinhos 14. A técnica de transfecção de lípidos permite o uso de uma pequena quantidade de proteína para alcançar o efeito. Isto limita a resposta inflamatória, que de outra forma seria provocada por administração da proteína. De fato, usando esta técnica nós publicamos que fomos capazes de aumentar significativamente a atividade PP2A no pulmão sem afetar pulmão celularidade do lavado 15. Lavagem pulmonar celularidade feita 24 horas após o desafio foi comparável com os controlos (27 ± 4 Controlo vs 31 ± 5 transfectada albumina, N = 6 por grupo). Além disso, aumenta os níveis de proteína sem induzir mudanças de desenvolvimento do pulmão ou mudanças de arquitectura que pode ocorrer em modelos transgénicos. No entanto, a necessidade de administrações repetidas podem tornar esta técnica menos favorável para estudos examinando os efeitos dos aumentos a longo prazo na expressão da proteína. Isto seria particularmente true de proteínas com uma meia-vida curta.
Protocol
1. Preparação de Proteína Reagente de Transfecção
- Dissolve-se o reagente Pro-Ject por adição de 250 ul de metanol e clorofórmio, para o tubo contendo a película seca.
- Vortex para 10-20 segundos a velocidade máxima.
- Pipetar 20 ul de reagente Pro-Ject em tubos de microcentrífuga separados.
- Evapora-se o solvente por meio de colocação dos tubos de microcentrífuga contendo o reagente Pro-Ject sob uma câmara de fluxo laminar durante um mínimo de 6 horas à temperatura ambiente. Ele deve estar completamente seca. Alternativamente, secar o reagente Pro-Ject usando um secador de vácuo.
- Armazenar os tubos a -20 ° C. Eles são bons para um ano a esta temperatura.
2. Adicionando a proteína reagente Pro-Ject
- Pipetar 50 ul de PBS, contendo 2,0 ug de proteína de interesse, dentro de um tubo contendo 20 ul de reagente de transfecção secas Pro-Ject.
- Após a adição da proteína, misturar a solução num vórtice a baixa velocidade fou 3-5 seg seguido de incubação durante 30 min à temperatura ambiente.
3. Administração Intratraqueal de Proteína
- Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg).
- Após sedação é alcançado, os ratos estão suspensos os incisivos superiores, utilizando uma plataforma especialmente concebidos (Figura 1).
- Utilizando uma pinça e um clipe de papel, como um laringoscópio, orofaringe é aberto de modo que o cateter pode ser introduzido (Figura 2). As cordas vocais são visualizados através da colocação de uma fonte de luz contra a traqueia do rato.
- A mistura reagente de proteína / projeto (50 ul) é injetado através da traquéia usando uma Penn Century microsprayer.
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Representative Results
Para demonstrar a eficácia da nossa técnica foi utilizada uma microsprayer (Penn Century) para injectar a traqueia de ratinhos com 2 mg de albumina de rato (Sigma) dissolvidos em 50 mL de PBS que continha 20 ul de reagente de transfecção Pro-Ject. Os ratinhos tratados com albumina foram comparados com os ratos que foram tratados de modo idêntico, com 2 ug de proteína de beta-galactosidase (Pierce Bio). Depois de vinte e quatro horas, os ratos foram sacrificados e os pulmões foram processados para análise histológica. A imuno-histoquímica para a beta-galactosidase foi realizado em secções de tecido fixadas em formalina pulmonares dos ratinhos tratados com albumina e beta-galactosidase. Mesmo 24 horas após a transfecção de proteínas, verificou-se a coloração intensa das vias aéreas (setas grandes) dos ratinhos tratados com beta-galactosidase, mas não os ratinhos tratados com albumina (Figura 3A e 3B).
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Figura 1. Para posicionar os ratos para a injecção intratraqueal, uma plataforma de madeira foi construído que tem uma rampa com um ângulo de 45 ° a partir da sua base 16. Os ratos estão suspensos os incisivos por um fio de metal que está ligado a dois ganchos de metal no topo a rampa. A língua é reposicionado delicadamente com uma pinça e clipe laringoscópio é utilizado para abrir as vias aéreas.
Figura 2. Após a colocação de uma fonte de luz no gargalo, a laringe pode ser visualizada por injecção intratraqueal 16.
Figura 3. immunostains β-galactosidase foram realizados em secções de pulmão de 4 mM de ratinhos injectados intratraquealmente com 2 ug dealbumina (A) ou β-galactosidase (B). setas indicam manchas β-galactosidase dentro das vias aéreas. As imagens são uma ampliação de 40X. Barra de escala = 100 mm.
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Discussion
A vantagem desta técnica em relação a outros métodos é que produz aumentos dos níveis de proteína e de actividade dentro do próprio tecido do pulmão. Além disso, ele penetra para as regiões distais do pulmão em vez de ficar apenas dentro das vias respiratórias. Nós medimos o aumento da atividade da proteína do nosso injetado mesmo depois lavaging as vias aéreas com soro fisiológico 15. As análises de actividade de tecido indicam que a proteína é entrar nas células e não apenas permanecem nos espaços aéreos do rato. Isto foi ainda confirmado por coloração imuno-histoquímica demonstrando a difuso da proteína injectada no interior dos alvéolos e as vias respiratórias do rato (Figura 3). É importante ressaltar que este protocolo não provoca inflamação pulmonar ou expressão de protease. Assim, quaisquer alterações que ocorrem podem ser atribuídas aos efeitos da proteína administrada. A falta de resposta inflamatória permite a utilização de injecções repetidas para examinar os efeitos sobre uma Longer período de tempo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (7R01HL098528-03) e Innovator Award Clínica FAMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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