Summary
Los ratones transgénicos o vectores virales se han utilizado para aumentar la expresión de la proteína en el pulmón. Sin embargo, estas técnicas son mucho tiempo, y técnicamente difícil tener efectos fuera de objetivo que pueden confundir los resultados. Nuestro protocolo de transfección de proteína utiliza un reactivo de transfección basado en lípidos y un microsprayer ultrafino para entregar de manera uniforme proteína activa a las células pulmonares.
Abstract
El aumento de la expresión de proteínas permite a los investigadores a entender mejor el papel funcional de esta proteína en la regulación de procesos biológicos clave 1. En el pulmón, esto se ha logrado típicamente a través de enfoques genéticos que utilizan ratones transgénicos 2,3 o vectores virales o no virales que elevan los niveles de proteína a través de aumento de la expresión del gen 4. Los ratones transgénicos son costosos y requiere mucho tiempo para la generación y la inserción aleatoria de un gen de expresión del transgen o crónica pueden alterar el desarrollo normal de los pulmones y por lo tanto limitar la utilidad del modelo 5. Mientras que los transgénicos condicionales evitar problemas asociados con la expresión crónica gen 6, los ratones transactivador controlado por tetraciclina inverso (rtTA), que se utilizan para generar la expresión condicional, se desarrollan espontánea aire ampliación espacio 7. Al igual que con los transgénicos, el uso de vectores virales y no virales es caro 8 y puede provocar dosis-drespuestas inflamatorias ependent que confunden los resultados 9 y dificultan la expresión 10. Por otra parte, la eficacia de las dosis repetidas están limitados por las respuestas inmunes mejoradas a el vector de 11,12. Los investigadores están desarrollando adeno-asociado vectores virales (AAV) que provocan una menor inflamación y tener una expresión más larga dentro del pulmón 13.
Uso de β-galactosidasa, se presenta un método para incrementar la expresión rápida y eficazmente la proteína dentro del pulmón utilizando una técnica directa de transfección de proteína. Este protocolo se mezcla una cantidad fija de proteína purificada con 20 l de un reactivo de transfección a base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir la penetración en el tejido pulmonar en sí. La mezcla de proteína liposómica se inyecta entonces en los pulmones de los ratones a través de la tráquea utilizando un microsprayer (Penn Century, Filadelfia, PA). El microsprayer genera una fina nube de aerosol líquido a través de los pulmones. Utilizando la técnicahemos demostrado la deposición uniforme de la proteína inyectada a través de las vías respiratorias y los alvéolos de los ratones 14. La técnica de transfección de lípidos permite el uso de una pequeña cantidad de proteína para lograr el efecto. Esto limita la respuesta inflamatoria que de otro modo sería provocado por alta administración de la proteína. En efecto, el uso de esta técnica hemos publicado que hemos sido capaces de aumentar significativamente la actividad de PP2A en el pulmón sin afectar pulmón celularidad lavado 15. Lavado pulmonar celularidad tomada 24 horas después de la exposición fue comparable a los controles (27 ± 4 Control vs 31 ± 5 albúmina transfectadas, N = 6 por grupo). Además, aumenta los niveles de proteína sin inducir cambios en el desarrollo del pulmón o cambios en la arquitectura que pueden ocurrir en modelos transgénicos. Sin embargo, la necesidad de administraciones repetidas puede hacer esta técnica menos favorable para los estudios que examinan los efectos de los aumentos a largo plazo en la expresión de la proteína. Esto sería particularmente true de las proteínas con una vida media corta.
Protocol
1. Preparación de Proteína reactivo de transfección
- Disolver el reactivo Pro-Ject mediante la adición de 250 l de metanol o cloroformo al tubo que contiene la película seca.
- Vortex durante 10-20 segundos a velocidad máxima.
- Pipetear 20 l de reactivo de Pro-Ject en tubos de microcentrífuga separados.
- Evaporar el disolvente mediante la colocación de los tubos de microcentrífuga que contiene el reactivo Pro-Ject bajo una campana de flujo laminar durante un mínimo de 6 horas a temperatura ambiente. Debe estar completamente seco. Alternativamente, secar el reactivo Pro-Ject utilizando un secador de vacío.
- Guarde los tubos a -20 ° C. Son válidos por un año a esta temperatura.
2. Añadir proteína a reactivo Pro-Ject
- Pipetear 50 l de PBS, que contenía 2,0 g de la proteína de interés, en un tubo que contiene 20 l de reactivo de transfección Pro-Ject seca.
- Después de agregar la proteína, mezcle la solución mediante agitación a baja velocidad fo 3-5 seg seguido por incubación durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Administración intratraqueal de Proteína
- Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg).
- Después se logra la sedación, los ratones son suspendidos de sus incisivos superiores utilizando una plataforma especialmente diseñado (Figura 1).
- El uso de pinzas y un clip de papel como un laringoscopio, se abre la orofaringe modo que el catéter puede ser introducido (Figura 2). Las cuerdas vocales se visualizan mediante la colocación de una fuente de luz frente a la tráquea del ratón.
- La mezcla de reactivos proteína / Proyecto (50 l) se inyecta a través de la tráquea utilizando un siglo Microsprayer Penn.
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Representative Results
Para demostrar la eficacia de nuestra técnica se utilizó una microsprayer (Penn Century) para inyectar la tráquea de los ratones con 2 mg de albúmina de ratón (Sigma) disuelto en 50 l de PBS que contenía 20 l de reactivo de transfección Pro-Ject. Los ratones tratados con albúmina se compararon con ratones que fueron tratados de manera idéntica con 2 g de proteína beta-galactosidasa (Pierce Bio). Después de veinticuatro horas los ratones fueron sacrificados y los pulmones se procesaron para el análisis histológico. Inmunohistoquímica para la beta-galactosidasa se llevó a cabo en secciones de tejido de pulmón fijados con formol y de los ratones tratados con albúmina y beta-galactosidasa. Incluso 24 horas después de la transfección de proteínas, hemos detectado una tinción intensa en las vías respiratorias (flechas grandes) de los ratones tratados con beta-galactosidasa, pero no los ratones tratados con albúmina (Figura 3A y 3B).
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Figura 1. Para posicionar los ratones para la inyección intratraqueal, una plataforma de madera fue construido que tiene una rampa en un ángulo de 45 ° desde su base 16. Los ratones se suspendieron de sus incisivos por un alambre de metal que se une a dos ganchos de metal en la parte superior de la rampa. La lengua se vuelve a colocar con cuidado con unas pinzas y un clip laringoscopio se utiliza para abrir las vías respiratorias.
Figura 2. Después de colocar una fuente de luz en el cuello, la laringe puede ser visualizado para la inyección intratraqueal 16.
Figura 3. inmunotinciones β-galactosidasa se realizaron en secciones de pulmón de 4 micras de ratones inyectados por vía intratraqueal con 2 g dealbúmina (A) o β-galactosidasa (B). Las flechas indican la tinción de β-galactosidasa dentro de las vías respiratorias. Las imágenes son a un aumento de 40X. Barra de escala = 100 micras.
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Discussion
La ventaja de esta técnica sobre otros métodos es que produce aumentos en los niveles de proteína y la actividad en el tejido pulmonar en sí. Por otra parte, penetra a las regiones más distales del pulmón en lugar de alojarse sólo dentro de las vías respiratorias. Hemos medido aumento de la actividad de proteínas de nuestra inyectado incluso después lavaging las vías respiratorias con solución salina 15. Los análisis de actividad del tejido indican que la proteína está entrando en las células y no sólo permanecen en los espacios de aire del ratón. Esto fue confirmado por inmunohistoquímica demuestra tinción difusa de nuestra proteína inyectada dentro de los alvéolos y las vías respiratorias del ratón (Figura 3). Es importante destacar que este protocolo no provoca la inflamación del pulmón o la expresión de proteasa. Por lo tanto, cualquier cambio que se producen pueden ser atribuidos a los efectos de la proteína administrada. La falta de respuesta inflamatoria permite el uso de inyecciones repetidas para examinar los efectos sobre una longer periodo de tiempo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (7R01HL098528-03) y el Premio a la Innovación Clínica de FAMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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