Summary
Transgene muizen of virale vectoren zijn gebruikt om eiwitexpressie te verhogen in de longen. Echter, deze technieken zijn tijdrovend, technisch uitdagend en hebben off-target effecten die resultaten kan verwarren. Onze eiwit transfectie protocol gebruikt een lipide gebaseerde transfectiereagens en een ultrafijne microsprayer om actief eiwit uniform te leveren aan longcellen.
Abstract
Verhogend eiwit expressie kunnen onderzoekers beter inzicht in de functionele rol van dat eiwit in het reguleren van de belangrijkste biologische processen 1. In de longen, dit is doorgaans bereikt door middel van genetische benaderingen transgene muizen 2,3 of virale of niet-virale vectoren die eiwitniveaus verhogen via verhoogde genexpressie 4 gebruiken. Transgene muizen zijn duur en tijdrovend te genereren en de willekeurige insertie van een transgen of chronische genexpressie kan normale longontwikkeling veranderen en hun uit bruikbaarheid van het model 5. Terwijl voorwaardelijke transgenen afwenden problemen met chronische genexpressie 6, omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator (rtTA) muizen, die worden gebruikt om voorwaardelijke expressie genereren, ontwikkelen spontaan luchtruim uitbreiding 7. Zoals bij transgene, het gebruik van virale en niet-virale vectoren is duur en 8 kunnen veroorzaken dosis-dependent ontstekingsreacties die beschamen resultaten 9 en expressie 10 belemmeren. Bovendien is de werkzaamheid van herhaalde doses worden beperkt door versterkte immuunreacties op de vector 11,12. Onderzoekers ontwikkelen adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren die minder ontstekingen veroorzaken en hebben meer expressie in de longen 13.
Gebruik β-galactosidase, presenteren we een werkwijze voor het snel en effectief verhogen eiwitexpressie in de longen via een directe eiwit transfectietechniek. Dit protocol combineert een vaste hoeveelheid gezuiverd eiwit met 20 ul van een lipide-gebaseerde transfectie reagens (Pro-Ject, Pierce Bio) te laten binnendringen in het longweefsel zelf. De liposomale eiwitmengsel wordt vervolgens geïnjecteerd in de longen van de muizen via de trachea met een microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). De microsprayer genereert een fijne pluim van vloeibare aërosol in de longen. Met de techniekwe hebben aangetoond uniforme afzetting van het geïnjecteerde eiwit gedurende de luchtwegen en alveoli van muizen 14. De lipide transfectie techniek maakt gebruik van een kleine hoeveelheid eiwit effect. Dit beperkt de ontstekingsreactie die anders door eiwitrijk administratie zou worden uitgelokt. Inderdaad, deze techniek gepubliceerde we dat we konden PP2A activiteit in de long significant te verhogen zonder de long lavage cellulariteit 15. Long lavage cellulariteit genomen 24 uur na challenge was vergelijkbaar met de controles (27 ± 4 controle versus 31 ± 5 albumine getransfecteerde; N = 6 per groep). Bovendien verhoogt eiwitgehalte en zonder het long ontwikkelingsveranderingen of bouwkundige veranderingen die kunnen optreden in transgene modellen. Echter, de noodzaak voor herhaalde toedieningen deze techniek minder gunstig voor studies naar de effecten van langdurige toename in eiwitexpressie maken. Dit zou bijzonder true voor eiwitten met korte halfwaardetijden.
Protocol
1. Voorbereiding van Protein transfectiereagens
- Los het Pro-Ject Reagent door toevoeging van 250 ul methanol en chloroform aan de buis met de droge film.
- Vortex gedurende 10-20 sec op topsnelheid.
- Pipetteer 20 ul van Pro-Ject reagens in afzonderlijke microcentrifuge buisjes.
- Damp het oplosmiddel door het plaatsen van de microcentrifuge buizen met de Pro-Ject reagens onder een laminaire stroming kap minimaal 6 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het moet volledig droog zijn. Als alternatief, droog de Pro-Ject reagens met een vacuümexsiccator.
- Bewaar de flesjes bij -20 ° C. Ze zijn goed voor een jaar bij deze temperatuur.
2. Het toevoegen van eiwit aan Pro-Ject Reagens
- Pipetteer 50 ul PBS, dat 2,0 ug van het eiwit van belang, in een buis met 20 pl droog Pro-Ject transfectie reagens.
- Na het toevoegen van het eiwit, meng de oplossing door vortexen bij lage snelheid fof 3-5 sec gevolgd door incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Intratracheaal Toediening van Protein
- Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (100 mg / kg en 10 mg / kg).
- Na sedatie is bereikt, worden muizen opgehangen aan de bovenste snijtanden behulp van een speciaal ontworpen platform (figuur 1).
- Behulp van een tang en een paperclip als laryngoscoop wordt de orofarynx, teneinde tot de katheter kan worden ingebracht (figuur 2). De stembanden worden gevisualiseerd door een lichtbron tegen de trachea van de muis.
- Het eiwit / ProJect reactiemengsel (50 pi) wordt geïnjecteerd door de trachea met behulp van een Penn Century Microsprayer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effectiviteit van onze techniek demonstreren we een microsprayer (Penn Century) de trachea van muizen te injecteren met 2 ug muizen albumine (Sigma) opgelost in 50 pl PBS dat 20 ul van Pro-Ject transfectie reagens bevatte. De albumine behandelde muizen vergeleken met muizen die werden behandeld op dezelfde wijze met 2 ug van beta-galactosidase eiwit (Pierce Bio). Na vierentwintig uur werden de muizen gedood en de longen werden verwerkt voor histologische analyse. Immunohistochemie voor beta-galactosidase werd uitgevoerd op formaline gefixeerd longweefsel gedeelten van de albumine en beta-galactosidase behandelde muizen. Zelfs 24 uur na transfectie eiwit ontdekten we intense kleuring in de luchtwegen (grote pijlen) van het beta-galactosidase behandelde muizen maar niet albumine behandelde muizen (figuur 3A en 3B).
_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Figuur 1. Om de muizen voor de intratracheale injectie positioneren, werd een houten platform gebouwd dat een helling bij een hoek van 16 van de sokkel 45 heeft. De muizen zijn opgehangen aan hun snijtanden door een metalen draad die is bevestigd aan twee metalen haken bovenaan de helling. De tong wordt voorzichtig gepositioneerd met een pincet en paperclip laryngoscoop wordt gebruikt om de luchtweg te openen.
Figuur 2. Na het plaatsen van een lichtbron op de hals, kan het strottenhoofd worden gevisualiseerd voor intratracheale injectie 16.
Figuur 3. β-galactosidase immunostains werden uitgevoerd op 4 urn longsecties van muizen intratracheaal geïnjecteerd met 2 ugalbumine (A) of β-galactosidase (B). Pijlen geven β-galactosidase kleuring in de luchtwegen. Beelden zijn bij 40x vergroting. Schaal bar = 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voordeel van deze techniek boven andere is dat het produceert toename in eiwit en de activiteit in het longweefsel zelf. Bovendien dringt het meest distale gebieden van de long in plaats blijven net binnen de luchtwegen. We hebben een verhoogde eiwit-activiteit van onze injectaat zelfs na lavaging de luchtwegen met een zoutoplossing 15 gemeten. Tissue activiteit analyses geven aan dat het eiwit cellen binnendringen en niet alleen blijven in de luchtruimten van de muis. Dit werd verder bevestigd door immunohistochemie tonen diffuse kleuring van onze geïnjecteerde eiwit in de alveoli en de luchtwegen van de muis (Figuur 3). Belangrijker is dit protocol niet provoceren longontsteking of protease expressie. Aldus kunnen wijzigingen die zich voordoen worden toegeschreven aan de effecten van de toegediende eiwit. Het ontbreken van inflammatoire respons staat het gebruik van herhaalde injecties om effecten te onderzoeken in een longer tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (7R01HL098528-03) en FAMRI's Klinische Innovator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
