Summary
Des souris transgéniques ou des vecteurs viraux ont été utilisés pour augmenter l'expression des protéines dans le poumon. Cependant, ces techniques sont fastidieux, difficile techniquement et avoir des effets hors-cible qui peut fausser les résultats. Notre protocole de transfection de la protéine utilise un réactif de transfection à base de lipides et une microsprayer ultrafine pour fournir uniformément protéine active à des cellules de poumon.
Abstract
L'augmentation de l'expression des protéines permet aux chercheurs de mieux comprendre le rôle fonctionnel de cette protéine dans la régulation de processus biologiques essentiels 1. Dans le poumon, ceci a été réalisé généralement par des approches génétiques qui utilisent des souris transgéniques 2,3 ou de vecteurs viraux ou non viraux qui élèvent les niveaux de protéines via une expression accrue du gène 4. Les souris transgéniques sont coûteux et chronophage pour générer et l'insertion aléatoire d'une expression de gène transgénique ou chroniques peuvent altérer le développement normal des poumons et donc limiter l'utilité du modèle 5. Alors que les transgéniques conditionnelles éviter les problèmes associés à l'expression chronique de gène 6, les souris inverse tétracycline transactivateur contrôlé (rtTA), qui sont utilisés pour générer une expression conditionnelle, développent spontanément élargissement de l'espace aérien 7. Comme avec les transgéniques, l'utilisation de vecteurs viraux et non viraux est cher 8 et peut provoquer des doses dréactions inflammatoires ependent que brouiller les résultats 9 et nuisent à l'expression 10. Par ailleurs, l'efficacité de doses répétées sont limitées par des réponses immunitaires renforcées au vecteur 11,12. Les chercheurs développent adéno-associé (AAV vecteurs viraux) qui provoquent moins d'inflammation et avoir plus d'expression dans le poumon 13.
Utilisation de β-galactosidase, nous présentons une méthode pour l'expression des protéines rapidement et efficacement croissante au sein du poumon en utilisant une technique de transfection directe des protéines. Ce protocole associe un montant fixe de protéine purifiée avec 20 pi d'un réactif de transfection à base de lipides (Pro-Ject, Pierce Bio) pour permettre la pénétration dans le tissu pulmonaire lui-même. Le mélange de protéines liposomale est ensuite injecté dans les poumons des souris via la trachée en utilisant un microsprayer (Penn siècle, Philadelphie, PA). Le microsprayer génère une amende panache d'aérosol liquide à travers les poumons. En utilisant la techniquenous avons démontré un dépôt uniforme de la protéine injectée à travers les voies respiratoires et les alvéoles de souris 14. La technique de transfection en lipides permet l'utilisation d'une petite quantité de protéine pour obtenir un effet. Cela limite la réponse inflammatoire qui serait autrement provoquée par l'administration riche en protéines. En effet, en utilisant cette technique, nous avons publié que nous avons réussi à augmenter de manière significative l'activité de PP2A dans les poumons sans affecter les poumons cellularité lavage 15. Lung lavage cellularité pris 24 heures après la provocation était comparable aux témoins (27 ± 4 contrôle contre 31 ± 5 transfectées albumine, N = 6 par le groupe). Par ailleurs, il augmente les niveaux de protéines sans induire les changements développementaux du poumon ou modifications architecturales qui peuvent se produire dans les modèles transgéniques. Cependant, la nécessité pour les administrations répétées peut rendre cette technique moins favorable pour les études portant sur les effets des augmentations à long terme dans l'expression des protéines. Cela serait particulièrement true pour les protéines à demi-vie courte.
Protocol
1. Préparation de la protéine réactif de transfection
- Dissoudre le réactif Pro-Ject en ajoutant 250 ul de méthanol ou le chloroforme dans le tube contenant le film sec.
- Vortex pendant 10-20 secondes à la vitesse supérieure.
- Pipette 20 ul de réactif Pro-Ject dans des microtubes séparés.
- Évaporer le solvant en plaçant les microtubes contenant le réactif Pro-Ject sous une hotte à flux laminaire pour un minimum de 6 heures à température ambiante. Il doit être complètement sec. Sinon, sécher le réactif Pro-Ject l'aide d'un dessiccateur à vide.
- Conserver les tubes à -20 ° C. Ils sont bons pour un an à cette température.
2. L'ajout de protéines de réactif Pro-Ject
- Distribuer 50 l de PBS, contenant 2,0 mg de la protéine d'intérêt, dans un tube contenant 20 pi de réactif de transfection séché Pro-Ject.
- Après l'ajout de la protéine, mélanger la solution au vortex à basse vitesse fou 3-5 sec suivie d'une incubation de 30 min à température ambiante.
3. L'administration intratrachéale de protéines
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine (100 mg / kg et 10 mg / kg).
- Après sédation est atteint, les souris sont suspendus à leurs incisives supérieures en utilisant une plate-forme spécialement conçue (figure 1).
- En utilisant des pinces et un trombone comme un laryngoscope, l'oropharynx est ouverte de sorte que le cathéter peut être introduit (Figure 2). Les cordes vocales sont visualisées en plaçant une source lumineuse contre la trachée de souris.
- Le mélange réactif protéine / projet (50 pi) est injectée à travers la trachée à l'aide d'un siècle Microsprayer Penn.
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Representative Results
Pour démontrer l'efficacité de notre technique, nous avons utilisé un microsprayer (Penn siècle) pour injecter la trachée des souris avec 2 pg de souris albumine (Sigma) dissous dans 50 pi de PBS qui contenait 20 pi de réactif de transfection Pro-Ject. Les souris traitées albumine ont été comparées avec des souris qui ont été traités de manière identique avec 2 pg de protéine bêta-galactosidase (Pierce Bio). Après 24 heures, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été traitées pour l'analyse histologique. Immunohistochimie pour la bêta-galactosidase a été réalisée sur des coupes de tissus fixés au formol pulmonaires des souris traitées albumine et la bêta-galactosidase. Même 24 heures après transfection de protéines, nous avons détecté une coloration intense dans les voies aériennes (grandes flèches) de la bêta-galactosidase souris traitées mais pas les souris traitées albumine (figure 3A et 3B).
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Figure 1. Pour positionner la souris pour l'injection intra-trachéale, a construit une plate-forme de bois qui a une rampe à un angle de 45 ° à partir de sa base 16. Les souris sont suspendus de leurs incisives par un fil métallique qui est fixé à deux crochets métalliques en haut de la rampe. La langue est légèrement repositionné avec une pince et un trombone laryngoscope est utilisé pour ouvrir les voies aériennes.
Figure 2. Après avoir placé une source lumineuse sur le cou, le larynx peut être visualisée à l'injection intra-trachéale 16.
Figure 3. immunomarquages β-galactosidase ont été réalisées sur des coupes de poumons 4 um de souris injectées intra-trachéale avec 2 ug d'albumine (A) ou β-galactosidase (B). flèches indiquent coloration β-galactosidase dans les voies respiratoires. Les images sont à un grossissement de 40X. Barre d'échelle = 100 um.
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Discussion
L'avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes est qu'elle produit une augmentation des niveaux de protéines et l'activité dans le tissu pulmonaire lui-même. En outre, il pénètre dans les régions les plus distales du poumon plutôt que de rester simplement dans les voies aériennes. Nous avons mesuré l'activité accrue des protéines de notre injectat même après lavaging les voies respiratoires avec une solution saline 15. Les analyses de l'activité de tissus indiquent que la protéine est entrée dans les cellules et ne reste pas dans les espaces aériens de la souris. Cela a été confirmé par immunohistochimie démontrant coloration diffuse de notre protéine injectée à l'intérieur des alvéoles et des voies respiratoires de la souris (Figure 3). Surtout, ce protocole ne provoque une inflammation des poumons ou de l'expression de la protéase. Ainsi, toutes les modifications qui se produisent peuvent être attribués aux effets de la protéine administrée. L'absence de réponse inflammatoire permet l'utilisation d'injections répétées d'examiner les effets sur une longer période de temps.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (7R01HL098528-03) et Innovator Award clinique de FAMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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