Summary
ट्रांसजेनिक चूहों या वायरल वैक्टर फेफड़ों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इन तकनीकों को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, समय लेने वाली हैं और परिणाम उलझाना सकता है कि बंद लक्ष्य प्रभाव है. हमारे प्रोटीन अभिकर्मक प्रोटोकॉल एक लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक और समान रूप से फेफड़ों की कोशिकाओं को सक्रिय प्रोटीन देने के लिए एक ultrafine microsprayer का उपयोग करता है.
Protocol
1. प्रोटीन अभिकर्मक अभिकर्मक की तैयारी
- सूखी फिल्म युक्त ट्यूब मेथनॉल या क्लोरोफॉर्म की 250 μl जोड़कर परियोजना के अभिकर्मक भंग.
- शीर्ष गति से 10-20 सेकंड के लिए भंवर.
- अलग microcentrifuge ट्यूबों में परियोजना के अभिकर्मक की पिपेट 20 μl.
- कमरे के तापमान पर 6 घंटे की एक न्यूनतम के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत परियोजना के अभिकर्मक युक्त microcentrifuge ट्यूबों रखकर विलायक लुप्त हो जाना. यह पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक निर्वात desiccator का उपयोग कर परियोजना के अभिकर्मक सूखी.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की दुकान वे इस तापमान से कम एक वर्ष के लिए अच्छे हैं.
2. परियोजना के अभिकर्मक के लिए प्रोटीन जोड़ना
- सूखे परियोजना के अभिकर्मक अभिकर्मक के 20 μl युक्त ट्यूब में, ब्याज की प्रोटीन की 2.0 ग्राम युक्त पीबीएस के पिपेट 50 μl,.
- प्रोटीन जोड़ने के बाद, कम गति पर च vortexing द्वारा समाधान मिश्रणया 3-5 सेकंड कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए incubating द्वारा पीछा किया.
3. प्रोटीन की intratracheal प्रशासन
- Ketamine / xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन (100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा चूहों anesthetize.
- बेहोश करने की क्रिया हासिल की है, के बाद चूहों के एक विशेष रूप से तैयार मंच (चित्रा 1) का उपयोग करते हुए अपने ऊपरी incisors से निलंबित कर दिया है.
- संदंश और एक कंठदर्शी के रूप में एक पेपर क्लिप का प्रयोग, oropharynx कैथेटर (चित्रा 2) को पेश किया जा सकता है ताकि खोला है. मुखर तार माउस की श्वासनली के खिलाफ एक प्रकाश स्रोत रखकर कल्पना कर रहे हैं.
- प्रोटीन / परियोजना अभिकर्मक मिश्रण (50 μl) एक पेन सदी Microsprayer उपयोग कर श्वासनली के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हमारे तकनीक के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए हम परियोजना के अभिकर्मक अभिकर्मक के 20 μl निहित है कि पीबीएस के 50 μl में भंग माउस के 2 ग्राम एल्बुमिन (सिग्मा) के साथ चूहों के ट्रेकिआ इंजेक्षन करने के लिए एक microsprayer (पेन सेंचुरी) का इस्तेमाल किया. एल्बुमिन इलाज चूहों बीटा galactosidase प्रोटीन की 2 ग्राम (पियर्स जैव) के साथ एक समान तरीके से इलाज किया गया है कि चूहों के साथ तुलना की गई. चौबीस घंटे के बाद, चूहों euthanized थे और फेफड़ों ऊतकीय विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया गया. बीटा galactosidase के लिए immunohistochemistry एल्बुमिन और बीटा galactosidase इलाज चूहों से formalin तय फेफड़े के ऊतकों वर्गों पर आयोजित किया गया. यहां तक कि 24 घंटा प्रोटीन अभिकर्मक के बाद, हम बीटा galactosidase इलाज चूहों के वायुमार्ग के भीतर तीव्र धुंधला (बड़े तीर) का पता चला, लेकिन नहीं एल्बुमिन इलाज चूहों (चित्रा 3 ए और 3 बी).
_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
चित्रा 1. Intratracheal इंजेक्शन के लिए चूहों की स्थिति के लिए, एक लकड़ी के मंच इसके आधार 16 से 45 डिग्री के कोण पर एक रैंप है कि निर्माण किया गया था. चूहों के शीर्ष पर दो धातु हुक से जुड़ा हुआ है कि एक धातु के तार से उनके कृन्तक से निलंबित कर रहे हैं रैंप पर. जीभ धीरे संदंश और पेपर क्लिप कंठदर्शी airway खोलने के लिए प्रयोग किया जाता है साथ repositioned है.
चित्रा 2. गर्दन पर एक प्रकाश स्रोत रखने के बाद, गला intratracheal इंजेक्शन 16 के लिए देखे जा सकते हैं.
चित्रा 3. β-galactosidase immunostains की 2 ग्राम के साथ intratracheally इंजेक्शन चूहों से 4 माइक्रोन फेफड़ों वर्गों पर आयोजित की गईएल्बुमिन (ए) या β-galactosidase (बी). तीर वायुमार्ग भीतर β-galactosidase धुंधला संकेत मिलता है. छवियाँ 40X बढ़ाई हैं. स्केल बार = 100 माइक्रोन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अन्य तरीकों पर इस तकनीक का लाभ यह है कि फेफड़े के ऊतकों के भीतर ही प्रोटीन का स्तर और गतिविधि में बढ़ जाती है कि उत्पादन है. इसके अलावा, यह सिर्फ वायुमार्ग के भीतर रहने के लिए विरोध के रूप में फेफड़ों के सबसे दूरस्थ क्षेत्रों के लिए प्रवेश. हम भी खारा 15 से वायुमार्ग lavaging के बाद हमारे injectate की वृद्धि प्रोटीन गतिविधि मापा है. ऊतक गतिविधि विश्लेषण प्रोटीन कोशिकाओं में प्रवेश कर रहा है और सिर्फ माउस की हवा रिक्त स्थान में नहीं रहता है कि संकेत मिलता है. यह आगे माउस के अलवियोली और वायुमार्ग (चित्रा 3) के भीतर हमारे इंजेक्शन प्रोटीन की फैलाना धुंधला प्रदर्शन immunohistochemistry द्वारा पुष्टि की गई. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल फेफड़ों की सूजन या प्रोटीज अभिव्यक्ति उत्तेजित नहीं करता है. इस प्रकार, होती है कि किसी भी परिवर्तन प्रशासित प्रोटीन के प्रभाव के लिए जिम्मेदार माना जा सकता है. भड़काऊ प्रतिक्रिया की कमी एक longe अधिक प्रभाव की जांच करने के लिए दोहराया इंजेक्शन के उपयोग के लिए अनुमति देता हैसमय के आर अवधि.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (7R01HL098528-03) और FAMRI क्लीनिकल अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
