Protein Transfection av Mouse Lung

Summary

Transgene mus eller virale vektorer har vært brukt for å øke protein-ekspresjon i lungen. Men disse teknikkene er tidkrevende, teknisk utfordrende og har off-target effekter som kan forvirrer resultater. Vår protein transfeksjon protokollen bruker en lipid baserte transfeksjon reagens og en ultrafine microsprayer til jevnt levere aktivt protein til lungeceller.

Abstract

Økende protein uttrykk gjør forskere til bedre å forstå den funksjonelle rollen som protein i å regulere viktige biologiske prosesser ^en. I lungene, dette har blitt oppnådd typisk gjennom genetiske tilnærminger som utnytter transgene mus ^2,3 eller virale eller ikke-virale vektorer som heve protein nivåer via økt genuttrykk ^fire. Transgene mus som er kostbare og tidkrevende å generere og den tilfeldig innsetting av et transgen eller kronisk genekspresjon kan endre normal lunge utvikling og dermed begrense nytten av modell ^5. Mens betingede transgenics avverge problemer forbundet med kronisk genekspresjon ^6, omvendt tetracyclin-kontrollerte transactivator (rtTA) mus, som brukes til å generere betinget uttrykk, utvikle spontan luftrom utvidelse ^7. Som med transgenics, er bruken av virale og ikke-virale vektorer dyre ⁸ og kan provosere dose-dependent inflammatoriske responser som forvirre resultater ⁹ og hindre uttrykk ^10. Videre er effekten av gjentatte doser begrenset av forbedrede immunresponser til vektor ^11,12. Forskere utvikler adeno-assosiert virus (AAV) vektorer som provoserer mindre betennelse og har lengre uttrykk i lungene ^13.

Ved hjelp β-galaktosidase presenterer vi en fremgangsmåte for hurtig og effektivt å øke protein ekspresjon i lungene ved hjelp av en direkte protein transfeksjon teknikk. Denne protokollen blander et fast beløp på renset protein med 20 pl av en lipidbasert transfeksjon reagens (Prosjektperiodiseringer, Pierce Bio) for å tillate inntrengning i lungevevet i seg selv. Den liposomale proteinblandingen blir deretter sprøytet inn i lungene til musene via trakea ved hjelp av en microsprayer (Penn-tallet, Philadelphia, PA). Den microsprayer genererer en fin sky av flytende aerosol gjennom lungene. Ved hjelp av teknikkenVi har vist ensartet avsetning av injisert protein gjennom luftveiene og alveolene av mus ^14.. Den lipid transfeksjon teknikk tillater bruk av en liten mengde protein for å oppnå effekt. Dette begrenser betennelsesreaksjon som ellers ville bli provosert av høy protein administrasjon. Faktisk bruker denne teknikken publiserte vi at vi var i stand til å betydelig øke PP2A aktivitet i lungene uten å påvirke lunge lavage cellularitet ^15. Lunge lavage cellularitet tatt 24 timer etter smitte var sammenlignbar med kontroller (27 ± 4 kontroll vs 31 ± 5 albumin transfekterte, N = 6 per gruppe). Dessuten øker det protein nivåer uten å indusere lunge utviklingsmessige endringer eller arkitektoniske endringer som kan oppstå i transgene modeller. Imidlertid kan behovet for gjentatte administrasjoner gjøre denne teknikken mindre gunstig for studier som undersøker effekten av langsiktige økninger i protein uttrykk. Dette vil være spesielt true for proteiner med korte halveringstider.

Protocol

En. Utarbeidelse av Protein Transfection Reagens

1. Oppløs-prosjekt reagens ved tilsetning av 250 pl av metanol eller kloroform til røret som inneholder den tørre filmen.
2. Vortex i 10-20 sek i full fart.
3. Pipetter 20 mL av Pro-Ject reagens i separate mikrosentrifugerørene.
4. Fordamp løsningsmidlet ved å plassere mikrosentrifugerør inneholdende Prosjektperiodiseringer-reagens under en laminær strømningshette i minst 6 timer ved romtemperatur. Det må være helt tørt. Alternativt tørke Pro-Ject reagens ved hjelp av en støvsuger eksikkator.
5. Oppbevar rørene ved -20 ° C. De er bra for ett år ved denne temperaturen.

2. Legge Protein til Pro-Ject Reagens

1. Pipetter 50 pl PBS, inneholdende 2,0 ug av proteinet av interesse, inn i et rør inneholdende 20 ul av tørket Prosjektperiodiseringer transfeksjon reagens.
2. Etter tilsetning av proteinet, blande oppløsningen ved omrøring ved lav hastighet feller 3-5 sek etterfulgt av inkubering i 30 min ved romtemperatur.

3. Intratrakeal Administration of Protein

1. Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin (100 mg / kg og 10 mg / kg).
2. Etter sedasjon er oppnådd, blir musene opphengt fra sine øvre fortenner ved hjelp av en spesielt utformet plattform (figur 1).
3. Ved å anvende pinsett og en binders som et laryngoskop, blir orofarynks åpnet slik at kateteret kan innføres (fig. 2). Stemmebåndene er visualisert ved å plassere en lyskilde mot luftrøret av musen.
4. Proteinet / prosjekt reagens blanding (50 pl) injiseres gjennom luftrøret ved hjelp av en Penn Century Microsprayer.

Representative Results

For å demonstrere effektiviteten av våre teknikk vi brukte en microsprayer (Penn Century) å injisere trakea hos mus med 2 ug mus albumin (Sigma) oppløst i 50 mL PBS som inneholdt 20 pl av prosjekt-transfeksjon reagens. Albuminet behandlede mus ble sammenlignet med mus som ble behandlet på en identisk måte med 2 ug av beta-galaktosidase-proteinet (Pierce Bio). Etter et døgn ble musene avlivet og lungene ble prosessert for histologisk analyse. Immunhistokjemi for beta-galactosidase ble gjennomført på formalin faste lunge vev seksjoner fra albumin og beta-galactosidase behandlede mus. Selv 24 timer etter transfeksjon protein, oppdaget vi intens farging i luftveiene (store piler) av beta-galaktosidase-behandlede mus, men ikke albumin-behandlede mus (figur 3A og 3B).

_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Figur 1. For å plassere musene for intratrakeal injeksjon, ble en tre-plattformen konstrueres som har en rampe i en 45 ° vinkel fra sin base ^16.. Musene er opphengt fra sine fortenner av en metalltråd som er festet til to metall kroker øverst rampen. Tungen er forsiktig flyttes med pinsett og binders laryngoskop brukes til å åpne luftveiene.

Figur 2. Etter å ha plassert en lyskilde på halsen, kan strupehodet bli visualisert for intratrakeal injeksjon ^16.

Figur 3. β-galaktosidase-immunostains ble gjennomført på 4-mikrometer lunge seksjoner fra mus injisert intratrakealt med 2 ugalbumin (A) eller β-galaktosidase (B). Pilene angir β-galaktosidase farging innenfor luftveiene. Bilder er på 40X forstørrelse. Scale bar = 100 mikrometer.

Discussion

Fordelen med denne teknikken fremfor andre metoder, er at det produserer en økning i protein nivåer og aktivitet innen lungevev selv. Videre, trenger den til de mest distale områdene av lungen i motsetning til bor bare innenfor det luftrom. Vi har målt økt protein aktivitet injektat vår selv etter lavaging luftveiene med saltvann ^15. Tissue aktivitet analyser indikerer at proteinet går inn celler og ikke bare forbli i luftrommene av musen. Dette ble ytterligere bekreftet ved immunhistokjemi demonstrere diffus farging av vår injisert protein i alveolene og luftveiene til mus (figur 3). Viktigere, denne protokollen ikke provosere lunge betennelse eller protease uttrykk. Således kan eventuelle endringer som forekommer tilskrives effekten av det administrerte protein. Mangelen på inflammatorisk respons tillater bruk av gjentatte injeksjoner for å undersøke effekter over et lengerer tidsperiode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Microsprayer	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidase	Pierce Bio	89850
Beta-galactosidase antibody	Santa Cruz Bio	SC-19119
Mouse serum albumin	Sigma Aldrich	A3139
Ketamine/xylazine	Sigma Aldrich	K113