Summary
Transgenik farenin ya da viral vektörler, akciğer içinde protein ekspresyonu artırmak için kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler teknik olarak zor, zaman alıcı ve sonuçları etkilemesi hedef dışı etkileri vardır. Bizim protein transfeksiyon protokolü bir lipid tabanlı transfeksiyon reaktif ve düzgün akciğer hücrelerine aktif bir protein sunmak için bir ultra ince Micro kullanır.
Abstract
Protein ekspresyonu arttırmak araştırmacılar daha önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde 1 o proteinin fonksiyonel rolünü anlamak için olanak sağlar. Akciğerde, bu artan gen ekspresyonu 4 ile proteini düzeylerini yükselten transgenik farenin 2,3 veya viral veya non-viral vektörlerin kullanmaktadır genetik yaklaşımlar, genellikle aracılığıyla elde edilmiştir. Transgenik farenin oluşturmak için pahalı ve zaman alıcıdır ve bir transgen ya da kronik gen ifadesinin rastgele yerleştirilmesi, normal akciğer gelişimi değişmesine neden olur ve bu nedenle modelin 5 yardımcı sınırlayabilir. Koşullu ifade oluşturmak için kullanılır kronik gen 6, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (rtTA) fareler ile ilişkili sorunları ortadan koşullu transgenik, kendiliğinden hava sahası genişleme 7 geliştirmek iken. Transgenik olduğu gibi, viral ve non-viral vektörlerin kullanımı 8 pahalı ve doz-D provoke edebilirBu ependent inflamatuar yanıtları sonuçları 9 yıkmak ve ifade 10 engel. Ayrıca, tekrarlı dozların etkinlik vektör 11,12 geliştirilmiş bağışıklık tepkileri ile sınırlıdır. Araştırmacılar daha az inflamasyon kışkırtmak ve akciğer 13 içinde uzun ifade var adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri geliştiriyoruz.
Β-galaktosidaz kullanarak, doğrudan bir proteini transfeksiyon tekniği kullanılarak, akciğer içinde hızla ve etkin biçimde artıran protein ekspresyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, akciğer dokusu, kendisi içine penetrasyon sağlamak için, bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi 20 ul (Pro-Ject, Bio Pierce) ile saflaştırılmış protein sabit tutar karışımları. Lipozomal proteini karışımı daha sonra, bir Micro (Penn Century, Philadelphia, PA) kullanılarak, trakea ile farelerin akciğerleri içine enjekte edilir. Micro akciğerler boyunca sıvı aerosol güzel bir tüy üretir. Tekniği kullanarakBu hava ve fareler 14. alveoller boyunca enjekte proteinin homojen birikimi göstermiştir. Lipid transfeksiyon teknik etki elde etmek için protein küçük bir miktarının kullanımına olanak sağlamaktadır. Bu aksi takdirde yüksek protein idare tarafından provoke olacağını inflamatuvar yanıt sınırlar. Gerçekten de, bu tekniği kullanarak biz önemli ölçüde akciğer lavajı hücreli 15 etkilemeden akciğerde PP2A etkinliği artırmak mümkün olduğunu yayınladı. Cebine 24 saat sonra alınan hücreli akciğer lavaj kontroller ile karşılaştırılabilir olmuştur (27 ± 31 genel 4 kontrol ± 5 albümin transfekte edilmiş, her grupta N = 6). Ayrıca, transgenik bir model oluşabilir akciğer gelişimsel değişimlerin veya yapısal değişiklikler neden olmadan proteini düzeylerini artırır. Ancak, tekrar yönetimlerin ihtiyacını protein ifadesinde uzun vadeli artar etkilerini inceleyen çalışmalar için bu tekniği daha az elverişli hale getirebilir. Bu durum, özellikle tru olacaktırkısa yarı ömürlü proteinler için e.
Protocol
1. Protein Transfeksiyon Reaktif hazırlanması
- Kuru film içeren tüp metanol ya da kloroform içinde 250 ul ekleyerek Pro-Ject Reaktif çözülür.
- En yüksek hızda 10-20 saniye girdap.
- Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içine Pro-Ject reaktif Pipet 20 ul.
- Oda sıcaklığında 6 saat arasında, en az bir laminar akış başlığı altında Pro-Ject Reaktif içeren mikrosantrifüj tüpleri yerleştirerek çözücü buharlaşır. Bu tamamen kuru olmalıdır. Alternatif olarak, vakum kurutma cihazı kullanılarak Pro-Ject reaktif kurutun.
- -20 ° C'de saklayın tüpleri Bunlar, bu sıcaklıkta bir yıl için iyidir.
2. Pro-Ject Reaktif Protein ekleme
- Kurutuldu Pro-Ject transfeksiyon reaktifi 20 ul içeren bir tüp içine, ilgilenilen proteinin 2.0 mg ihtiva eden PBS Pipet 50 ul.
- Protein ilave edildikten sonra, düşük hızda F vorteks çözüm karıştırmakya da 3-5 saniye oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya izledi.
3. Protein içine tatbik
- Ketamin / ksilazin intraperitoneal (100 mg / kg ve 10 mg / kg) ile farenin anestezisi.
- Sedasyon elde edildikten sonra, fareler, özel olarak tasarlanmış bir platform (Şekil 1) kullanılarak üst kesici dişler asılmıştır.
- Forseps ve bir laringoskop gibi bir ataş kullanarak, orofarenks kateter (Şekil 2) tanıtılacak böylece açılır. Ses telleri fare trakea karşı bir ışık kaynağı koyarak görüntülenmiştir.
- Protein / ProJect reaktif karışımı (50 ul) bir Penn Yüzyıl Micro kullanarak trakea yoluyla enjekte edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim tekniğin etkinliğini göstermek amacıyla Pro-Ject transfeksiyon reaktifi 20 ul PBS içeren 50 ul içinde eritildi fare 2 ug albümini (Sigma) ile farelerin trakea enjekte etmek için bir Micro (Penn Century) kullanılmıştır. Albümin tedavi edilen fareler bir beta-galaktosidaz protein 2 ug (Pierce Biyo) ile benzer bir şekilde muamele edilmiştir farenin ile karşılaştırıldı. Yirmi dört saat sonra, fareler kurban edildi ve akciğerler histolojik analiz için hazırlandı. Bir beta-galaktosidaz için İmmünohistokimya albümin ve beta-galaktosidaz tedavi edilen farelerden alınan formalin ile tespit akciğer doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Hatta, 24 saat transfeksiyondan sonra protein, böylece bir beta-galaktosidaz tedavi edilen farelerin hava yolları içinde yoğun boyama (büyük oklar) tespit değil albümin tedavi edilen fareler (Şekil 3A ve 3B).
_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Şekil 1. İntratrakeal enjeksiyon için farenin konumlandırmak için, bir ağaç platformu, taban 16 ile 45 ° 'lik bir açıda bir rampa şekilde imal edilmiştir. Farenin en azından iki metal kanca eklenmiş bir metal tel kendi kesici asılmıştır rampa. Dil hafifçe forseps ve ataş laringoskop hava yolu açmak için kullanılan ile yeniden konumlandırılır.
Şekil 2. Boyun bir ışık kaynağı yerleştirdikten sonra, gırtlak intratrakeal enjeksiyon 16 için görüntülenebilir.
Şekil 3,. β-galaktosidaz immunohistokimyasal 2 ug ile nefes borusunun içine enjekte edilen farelerden alınan 4-mikron akciğer kesitleri üzerinde yapılmıştıralbümini (A) ya da β-galaktosidaz (B). Oklar hava yolları içinde β-galaktosidaz boyama göstermektedir. Görüntüler 40X büyütme altındadır. Ölçek çubuğu = 100 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diğer yöntemler üzerinde bu tekniğin avantajı, akciğer dokusunun kendisi içinde protein seviyeleri ve aktivite artışı, üretmesidir. Ayrıca, bu sadece hava yolları içinde kalan karşıt olarak akciğerin en uzak bölgelere nüfuz eder. Hatta tuzlu 15 ile hava lavaging sonra enjektat artan protein aktivitesi ölçüldü. Doku etkinlik analizleri protein hücreleri giriyor ve sadece fare hava boşlukları kalır olmadığını göstermektedir. Bu da fare alveoller ve hava yolları (Şekil 3) içinde bizim enjekte protein yaygın boyanma gösteren immünohistokimyasal olarak doğrulandı. Önemlisi, bu protokol akciğer iltihabı veya proteaz ifade provoke etmez. Bu nedenle, meydana yapmak herhangi bir değişiklik uygulanan protein etkilerine atfedilebilir. Inflamatuvar yanıt eksikliği bir kement üzerinde etkilerini incelemek tekrarlanan enjeksiyon kullanımı için izin verirZaman r süre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (7R01HL098528-03) ve FAMRI Klinik Yenilikçi Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
