4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

Summary

Cellulär livsduglighet beror på tid och effektiv förvaltning av protein felveckning. Här beskriver vi en metod för att visualisera de olika potentiella öden en felveckade proteiner: återveckning, nedbrytning, eller beläggs med kvarstad i inneslutningar. Vi visar användningen av en hopfällbar sensor, Ubc9

Abstract

En av de viktigaste uppgifterna för varje levande cell upprätthålla korrekt veckning av nyligen syntetiserade proteiner i ansiktet av ständigt föränderliga miljöförhållanden och en intracellulär miljö som tätt packade, klibbiga och farliga för proteinstabilitet ^1. Förmågan att dynamiskt balansera proteinproduktion, vikning och nedbrytning kräver högt specialiserad maskiner kvalitetskontroll, vars absolut nödvändighet observeras bäst när det inte fungerar. Sjukdomar som ALS, Alzheimers, Parkinsons, och vissa former av cystisk fibros har en direkt koppling till protein folding komponenter kvalitetskontroll ^2, och därför framtida terapeutisk utveckling kräver en grundläggande förståelse av underliggande processer. Vår experimentella utmaning är att förstå hur celler integrerar skador signaler och montera svar som är anpassade till olika omständigheter.

Den främsta anledningen till varför protein felveckning utgör en existentiell threpå att cellen är benägenheten hos felaktigt veckade proteiner att aggregera, vilket orsakar en global störning av den överfulla och känsliga intracellulära fällbar miljö ^1. Den fällbara hälsa, eller "proteostasis," av det cellulära proteom bibehålls, även under tvång av åldrande, stress och oxidativ skada, genom samordnade åtgärder av olika mekanistiska enheter i ett utstuderat system för kvalitetskontroll ^3,4. En specialiserad maskineri av molekylära chaperoner kan binda främmande polypeptider och främja deras vikning i det nativa tillståndet ^1, rikta dem för nedbrytning av ubiquitin-proteasom-systemet ^5, eller hänvisa dem till skyddande aggregering inneslutningar ^6-9.

I eukaryoter är cytosoliska aggregering kvalitetskontroll belastning fördelas mellan två fack ^8-10: den juxtanuclear kvalitetskontroll fack (JUNQ) och det olösliga proteinet deposition (IPOD) (Figur 1 - modell).Proteiner som ubiquitinerade av proteinveckning kvalitetskontroll maskiner levereras till JUNQ, där de behandlas för nedbrytning genom proteasomen. Felveckade proteiner som inte är ubiquitinerade vidarekopplas till iPod, där de aktivt samman i en skyddande fack.

Fram till denna punkt har den metodologiska paradigm levande celler fluorescensmikroskopi i stort sett varit att märka proteiner och spåra sina platser i cellen vid specifika tidpunkter och oftast i två dimensioner. Som ny teknik har börjat ge praktiker oöverträffad tillgång till submikron skala i levande celler, har den dynamiska arkitektur cytosolen kommer i vyn som en utmanande ny gräns för experimentell karakterisering. Vi presenterar en metod för att snabbt övervaka 3D rumsliga fördelningen av flera fluorescensmärkta proteiner i jäst cytosolen över tiden. 3D Timelapse (4D imaging) är inte bara en teknisk utmaning, råttahenne, underlättar också en dramatisk förändring i den begreppsmässiga ram som används för att analysera cellulär struktur.

Vi använder en cytosoliskt hopfällbar sensor protein i levande jäst för att visualisera olika öden för felveckade proteiner i cellulära aggregering kvalitetskontroll, med snabb 4D fluorescerande avbildning. Den temperaturkänsliga mutant av Ubc9 proteinet ^10-12 (Ubc9 ^ts) är extremt effektiv både som en sensor av cellulär proteostasis, och en fysiologisk modell för att spåra aggregering kvalitetskontroll. Som med de flesta ts proteiner är Ubc9 ^ts fullt vikta och funktionella vid tillåtande temperaturer på grund av aktiva cellulära chaperoner. Över 30 ° C, eller när cellen står inför felveckning stress, Ubc9 ^ts misfolds och följer ödet för en infödd globulärt protein som har felveckade grund av mutation, värmedenaturering eller oxidativ skada. Genom att fusera den till GFP eller andra fluoroforer, kan den spåras i 3D eftersom den bildar stress Foci, eller är directed till JUNQ eller iPod.

Protocol

1. Jäst Förberedelser

1. Förvandla jäststammar med en plasmid som bär en GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ^ts) kassett.
2. Grow jästen i syntetiska medier innehållande 2% raffinos för 24 timmar och tillbaka utspäddes till 2% galaktos innehållande media under 16 timmar eller O / N. Inkubera cellerna vid 30 ° C under skakning vid 200 varv per minut.
3. Följande morgon, späd frågan stammen till OD ₆₀₀ = 0,2. Skaka under 4-6 timmar vid 30 ° C (200 rpm) tills kulturen når OD ₆₀₀ = 0,8-1,0.
4. Att undertrycka expression (för att övervaka endast den redan översatt och vikta pool av GFP-Ubc9 ^ts), ändra media till syntetiska media kompletterat med 2% glukos (SD) 30 min före avbildning.
5. Behandling - Värmechock cellerna under 20 minuter vid 37 ° C för att framkalla misfolding, eller kontinuerligt i mikroskop inkubator för att följa proteinaggregering i värme-chocktillstånd. Obs - Om du använder mikroskop vid någon temperatur över RT förvärmning FOR ca 2 timmar för att få samma temperatur längs kroppen av mikroskopet och målen (se nedan).

2. Platta \ Slide Förberedelser

1. Välja lämplig platta. Det viktigaste skälet är förmågan att hålla fokus under avbildning förvärvet. Följande punkter är avgörande för 4D avbildning och inte för 2D tid förfaller eller 3D avbildning.
   1. Flera brunnar platta-botten av olika brunnar kan inte vara homogen (dvs. brunnarna kommer att vara på olika höjder i förhållande till målet). Detta kommer att göra det svårt att behålla fokus hela xy punkter och punkter tid, oavsett autofokusering tekniken som används.
   2. Skjut material: glas kontra plast. Glas botten bilder är mer z-homogen mellan brunnar, men är dyrare.
   3. Tjocklek av plattan botten: vi brukar använda täckglaset-bottenplattor index 1,5, men index 1 är också godtagbar beroende på målet.
2. Cover botten av plattan \ objektglaset med ConA (0,25 mg / ml) under 10 minuter. ConA användes för att vidhäfta cellerna till objektglaset, vilket möjliggör efter en enda cell över tiden.
3. Ta ConA och inkubera bilden i en kemisk huva så att överskott ConA kommer att avdunsta.
4. Platta 200 pl jäst prov (OD ₆₀₀ = 0,5) i ConAed väl.
5. Inkubera under 15 minuter, för att möjliggöra celler fastnar på ytan av plattan.
6. Extrahera mediet och tvätta tre gånger med nytt medium för att få ett skikt av celler. Obs: om en lång tid förflutit planeras, utsäde cellerna glest så att nya knoppar inte fyller och avbryta det intressanta området.

3. Mikroskop Förberedelser

1. Vi använder en Nikon A1Rsi konfokalmikroskop med några icke-standardiserade ändringar. För jäst avbildning använder vi upp till 4 lasrar (405 nm, 50 mW CUBE laser, 457-514 nm, 65 mW argonjonlaser, 561 nm, 50 mW Sapphire laser och 640 nm, 40 mW CUBE laser), och upp till 4 PMT utrustade medfilter. De flesta av våra avbildning sker med ett grönt filter set för EGFP och ett rött filter set för mCherry och tdTomato. Med GFP och mCherry det finns nästan ingen bleedthrough, därför vi ofta använder samtidig skanning. Emellertid kan linje-scanning också användas för att förhindra bleedthrough när det inträffar. Vår konfokala är också utrustad med en PInano Piezo steg (MCL), vilket kan göra 3 msek steg i z, så 2-3 z-stackar (30-50 delar) per sekund. Systemen har också en spektral detektor, perfekt fokus (laser offset), och två scanners - en galvano scanner och en resonant skanner.
2. Välj lämpligt mål. Huvudsakliga överväganden:
   1. Vatten / olja / luft mål: den huvudsakliga faktorn är brytningsindex för det bildgivande mediet mot mediet av provet.
      1. Olja objektiva fördelar:
         1. Olja mål kan ha högre bländare (olja bryter ljus mer än vatten, och därför mer fotoner gå tillbaka till målet). Olja mål kan ha upptill NA 1,49, jämfört med 1,27 för vatten. (Detta är dock egentligen inte en enorm skillnad i upplösning).
         2. Brytningsindex av olja matchar brytningsindex glas, därför inga fotoner går förlorade går från provet, genom glaset, till målet. (Obs - valde en immersionsolja som har ett brytningsindex som är lämplig för ditt mål och din täckglaset).
         3. Olja kan problemfri lång tid-bortfaller eftersom den inte avdunstar.
         Olja Mål nackdelar:
         1. Den högre upplösningen möjliggörs genom högre NA av olja mål bryts snabbt om ljuset måste färdas genom ett vattenhaltigt medium (t.ex. en cell).
         2. Bilder har oftast mer sfärisk aberration och en "utsträckt" effekt i 3D.
         3. Olja är klibbig, rörig, och en fara för målen.
      2. Vatten objektiva fördelar
         1. Själva cellen är vattenhaltig, därför finns färre snedvridningar i Z, ennd upplösningen fortsatt hög djupt in i en vattenhaltig prov.
         2. Rengör och användarvänlig. Vatten objektiva nackdelar: avdunstar snabbt, därför inte lämplig för långa filmer utan speciella arrangemang som görs för att pumpa vatten kontinuerligt till målet.
      3. Air objektiva fördelar: 1. Inget material går förlorat / avdunstar under flera punkten förvärv eller en lång film. 2. Rengör och användarvänlig. Nackdel: låg upplösning och låg signal känslighet.
   2. Rum och inkubator temperatur: föränderlig temperatur påverkar materia egenskaper, och i känsliga system ändrar fokus. Temperaturen bör justeras innan man väljer poäng för förvärvet. Ändra temperaturen under förvärvet kommer att störa avbildning och kommer att resultera i förlust av fokus. Vi låter vårt mikroskop systemet jämvikt under 2 timmar vid önskad temperatur innan avbildning.
   3. Korrigering kragar: Många mål kommer med en korrigering ring gördet mål som skall justeras för en given täckglas tjocklek. Vi rekommenderar att justera korrigeringen kragen när du använder fluorescerande pärlor att visualisera funktionen punkt spridning. Detta kommer att säkerställa rätt inställningar för varje prov.
   4. Stabila provhållare: vi finner att de flesta kommersiellt tillgängliga provhållare är den svagaste delen av mikroskop. De är ofta vinglig och inte rak. Detta är en katastrof för hög upplösning, med flera punkter 4D avbildning. Vi designar våra egna provhållare som är raka och passar ordentligt på scenen. De kan också skruvas fast vid behov.
   5. Multi-point förvärv: vårt bildsystem är utrustad med Nikons "Perfekt fokus"-systemet, som är i grunden en laserbaserad autofokus mekanism. Emellertid är autofokusering inte nödvändigtvis nödvändigt med 4D avbildning, speciellt om systemet inte driva en hel del.

4. Imaging

1. Slå på systemet: laser, scen, Controller, kamera och datoTER programvara.
2. Placera plattan på scenen hållare, ordentligt förankrade och stabiliserats.
3. Använd öga port att bestämma placeringen och orienteringen av jäst.
4. Med hjälp ljusfält, bedöma cellens hälsa och livskraft hänsyn till form och konsistens.
5. Aktivera epifluorescent ljus enlighet med den relevanta fluoroforen (t.ex. FITC filter för GFP), och fokusera på celler som uppvisar fenotypen som är föremål för din forskning. Celler som är starkt fluorescerande i mer än en våglängd kan vara död och därför autofluorescerande. Vi visualiserar kärnan med en tdTomato fluorofor smält till en SV40 NLS (NLS-TFP). TFP är dubbelt så stor som GFP, och är därför över diffusion gränsen av kärnan, därför fungerar mycket bra som en nukleär markör. Vi kan också väcka TFP med en grön (488 nm) laser samtidigt som GFP, men samla de gröna och röda utsläpp i två separata PMT för spektral upplösning.
6. Justera följande inställningar för att minimera bulleroch övermättnad:
   1. Laser makt - ska fotoblekning och fototoxicitet kontra ljusstyrka bilden övervägas.
   2. Förstärkning: påverkar kamerans känslighet, vilket signal-brusförhållande.
   3. Pinhole diameter - bör justeras i enlighet med laser med kortare våglängd. Pinhole Diametern bestämmer tjockleken (höjden) av den optiska delen avbildas. Således kommer öppna pinhole samla in mer ljus (låta fler fotoner i), men kommer att minska upplösningen i z (mindre confocality).
7. Nyttiga tips:
   1. Om olika fluoroforer avger kongruent våglängd, använd Spectral Detector funktion som gör det möjligt att välja virtuella filter. Tänk på att spektrala detektorer är mindre känsliga än vanliga PMT.
   2. Om olika fluoroforer är entusiastiska med samma laser, använda funktionen linje skanning.
   3. En Galvano scanner möjliggör mer känslighet, men har en högre risk för fotoblekning. En Resonant skanner möjliggör snabbare encquisition, vilket sänker risken för fotoblekning, men är mindre känsligt.
   4. Medelvärdesbildning mellan 2 och 16 bilder, förbättrar det signalbrusförhållandet, men gör förvärv långsammare och, naturligtvis, innebär mer exponering av provet till lasern.
   5. Varaktighet på förvärvsrelaterade beror på biologiska fråga (t.ex. JUNQ och IPOD bildning tar ~ 2 timmar). Vi har avbildat jäst med resonans scannern för upp till 30 timmar i 3D tidsintervaller.
   6. Time lapse intervall-Mindre intervall kommer att skapa en mer sammanhängande film men kan orsaka foto blekning och därmed förlust av signal.

Representative Results

Figur 1. Modell:. Subcellulär uppdelning av felveckade proteiner Kvalitetskontroll maskiner leder felveckade proteiner i distinkta fack med olika funktioner: lösliga proteiner, riktade för nedbrytning, genomgår poly-ubikitinering och skickas till Ju XTA-N uclear Q VALITET kontroll fack (JUNQ ). Olösliga proteiner som inte kan ubiquitinerade skickas för säkerhetsåtgärd för jag nsoluble Pr otein D eposit (iPod), intill vakuolen, där de genomgår aktiv aggregering.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg "/>
Figur 2. Modellering protein felveckning med GFP-Ubc9 ^ts. Under normala förhållanden, är GFP-Ubc9 ^ts (grön) inbyggt vikta, och är lokaliserad diffust i kärnan och cytosolen. Kärnan är märkt med NLS-TFP (röd). Uttryck av Ubc9 ^ts stängdes av genom tillsats av 2% glukos före avbildning i alla experiment. Klicka här för att se större bild .

1. Vid temperaturer övergång till 37 ° C, GFP-Ubc9 ^ts (grön) felveckade och bildar cytosoliska Stress Foci. Kärnan är märkt med NLS-TFP (röd).
2. Efter återhämtning från värmechock vid 23 ° C, termiskt denatureras GFP-Ubc9 ^ts försämras, såsom indikeras av minskad fluorescens nivå.
3. Vid temperaturer övergång till 37 ° C och proteasom-inhibition med 80 Mm MG132, GFP-U bc9 ^ts är felveckade och bearbetas till JUNQ och inneslutningar IPOD. Kärnan är märkt med NLS-TFP (röd).
4. Vid temperaturer övergång till 37 ° C och ubiquitinering hämning är GFP-Ubc9 ^ts felveckade och bearbetas i iPod integration. Kärnan är märkt med NLS-TFP (röd). Ubiquitin Proteas 4 (Ubp4) överuttrycks att blockera Ubc9 ^ts ubikvitinering.

Figur 3. Tidsförloppet för JUNQ och iPod bildning. Efter temperatur övergång till 37 ° C och proteasom-inhibition med 80 Mm MG132 är GFP-Ubc9 ^ts Stress Foci bearbetas till JUNQ och inneslutningar IPOD. Kärnan är märkt med NLS-TFP (röd). 3D-bilder förvärvades till 4 minuters intervall. (Se även film 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

Discussion

Våra intuitioner om biokemiska processer härrör från experiment bänkskiva där en väl blandad lösning av reaktanter och produkter tillåts att nå jämvikt i en bägare. I en sådan inställning, kan koncentrationen av en given kemisk species uttryckas som ett enda tal, vilket är förhållandet mellan en molär mängd av molekyler till en makroskopisk volym. Mycket av det vi vet om proteiners struktur och funktion härrör från att använda metoder som återspeglar den klassiska, bulk reaktion bild: western blotting, centrifugering och spektrofotometriska mätningar som utförts på extrakt från homogenat av hela populationer av celler.

Som den teknik vi använder för att titta på celler under förstoring förbättras med stormsteg, blir det allt tydligare att de förhållanden under vilka de flesta biokemiska reaktioner sker in vivo bär endast den minsta likhet med dem i det klassiska bänk scenario. Inte bara är det inre av celLa packade tätt miljö, där trängsel effekter väsentligt förändrar verksamheten i olika reaktanter är det också tvärtom av väl blandat. Detta förklarar den ofta skillnaden mellan in vitro och in vivo effektiviteten hos ett brett spektrum av komplexa makromolekylära reaktioner.

Ingenstans är intuitioner som härrör från klassisk in vitro biokemiska experiment mer benägna att vilseleda i frågor som hänför sig till in vivo-vikning, felveckning och aggregering av proteiner. Medan studier av proteinkemi i bulk reaktioner kan behandla frågan om vika för ett givet protein som en enkel ja eller nej fråga måste alla försök att spåra dynamiken i hela populationer av makromolekyler i en levande cell vara känslig för hela fördelningen av möjliga konformationella resultat tillgängliga för en polypeptidkedja, och särskilt risken för felveckning och aggregering. Till exempel kan vi undersöka en bulk cell lysatt av en aggregerande protein genom western blotting, och bestämma att proteinet är mestadels olösligt och inte ubiquitineras. Emellertid, i den levande cellen en diskret subpopulation av proteinet, svåra att upptäcka när genomsnitt över många celler, kan vara lösliga och ubiquitineras i en viss avdelning där den lokala koncentrationen av arten är extremt hög. Det senare scenariot kan ha mer betydande konsekvenser för lönsamheten i cellen än den större delen delpopulation. Dessutom, medan chaperones visa olika pleiotropa beteenden och funktioner in vitro, blir det uppenbart att i cellen deras diskreta funktioner rumsligt och tidsmässigt begränsad.

I den nyligen framväxande paradigm för att förstå biokemi, blir koncentrationen en variabel egenskap hos varje specifik nano-miljö i cellen, och de molekylära händelser som ligger till grund för biologiska processer måste analyseras inte bara i tid, men också i SPACe. 4D avbildningsteknik som presenteras här kan känslig modellering av protein felveckning i levande celler, men det kan användas för att studera ett antal andra biologiska processer och hur de regleras i rum, tid, och efter förändringar i miljöförhållanden. I detta dokument använder vi Ubc9 ^ts fällbara sensor som effektivt demonstrerar stegen och alternativ för att hantera uppkomsten av proteinaggregering i cytosolen. Förutom att illustrera cellbiologin om sammanläggning kvalitetskontroll kan detta tillvägagångssätt fungera som ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera effekten av specifika störningar eller genetiska mutationer på proteostasis (exempelvis Ubc9 ^ts kan användas för att mäta proteinveckning stress som svar på oxidation, uttrycket av en toxisk aggregat, eller mutationer i kvalitetskontroll vägen).

4D avbildning är också viktigt för noggrann bestämning proteinlokalisering eller samlokalisering mellan två olika proteiners och för detektering fenomen som kanske vara övergående men viktiga. Till exempel, speciellt i en liten sfärisk organism, såsom jäst, kan det tyckas vara så att en struktur eller aggregat har juxtanuclear lokalisering, medan 4D avbildning kan visa att detta är helt enkelt en artefakt av vinkeln för inspektion.

I exemplet experimentet vi presenterar här, visar vi att använda en modell felveckade proteiner, Ubc9 ^ts att följa kontrollen aggregering kvalitet över tid och rum i cytosolen. Vid den tillåtna temperaturen, är Ubc9 ^ts viks och diffunderade i kärnan och cytosolen. Vid värmeinducerad misfolding bildar det inledningsvis snabbt sprida små Foci sammanlagda stress som behandlas för proteasomal nedbrytning. När proteasomen partiellt inhiberas, är dessa Stress Foci omvandlas till JUNQ och inneslutningar IPOD under loppet av ca 2 timmar. Om ubiquitinmedierad nedbrytning är inte tillgänglig som en kvalitetskontroll alternativ, UbC9 ^ts omedelbart omdirigeras till iPod integration för skyddande aggregering. Dessa verktyg ger otroliga möjligheter att upptäcka nya genetiska faktorer som aggregering kvalitetskontroll och att undersöka deras rumsliga och tidsmässiga reglering i cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Glass bottom plates	ibidi	ibd81158
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.