4D Imaging af proteinaggregering i levende celler

Summary

Cellulær levedygtighed afhænger af rettidig og effektiv forvaltning af protein misfoldning. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at visualisere de forskellige potentielle skæbner en fejlfoldede protein: refoldning, nedbrydning eller binding i inklusioner. Vi demonstrerer brugen af ​​en foldning sensor, Ubc9

Abstract

Et af de vigtigste opgaver for enhver levende celle er at opretholde korrekt foldning af nysyntetiserede proteiner i lyset af stadigt skiftende miljøforhold og et intracellulært miljø, der er tætpakkede, klæbrig, og farlige til protein stabilitet ^1. Evnen til dynamisk balance proteinproduktion, foldning og nedbrydning kræver højt specialiseret kvalitetskontrol maskiner, hvis absolutte nødvendighed observeres bedst, når den ikke fungerer. Sygdomme som ALS, Alzheimers, Parkinsons, og visse former for cystisk fibrose har et direkte link til proteinfoldning kvalitetskontrol komponenter ^2, og således at en fremtidig terapeutisk udvikling kræver en grundlæggende forståelse af de underliggende processer. Vores eksperimentelle udfordring er at forstå, hvordan celler integrerer skader signaler og montere reaktioner, der er skræddersyet til forskellige forhold.

Den primære grund til, at protein misfoldning repræsenterer en eksistentiel threved til cellen, er tilbøjelighed forkert foldede proteiner til aggregat, og dermed forårsager en global forstyrrelse af overfyldte og delikate intracellulær folde miljøet ^1. Den sammenklappelige helbred, eller "proteostasis", af den cellulære proteom opretholdes, selv under tvang af befolkningens aldring, stress og oxidative skader, ved en koordineret indsats af forskellige mekanistiske enheder i et omfattende kvalitetskontrolsystem ^3,4. En specialiseret maskineri af molekylære chaperoner kan binde non-native polypeptider og fremme deres folde ind i den native tilstand ^1, målrette dem til nedbrydning af ubiquitin-proteasom system ^5, eller henvise dem til beskyttende aggregering indeslutninger ^6-9.

I eukaryoter, er den cytosoliske aggregation kvalitetskontrol belastning delt mellem to rum ^8-10: den juxtanuclear kvalitetskontrol rum (JUNQ) og det uopløselige protein deponering (iPod) (fig. 1 - model).Proteiner, der ubiquitinerede af proteinfoldning kvalitetskontrol maskineri leveres til JUNQ, hvor de forarbejdes til nedbrydning af proteasomet. Fejlfoldede proteiner, der ikke ubiquitinerede er blevet omdirigeret til IPOD, hvor de aktivt aggregeres i et beskyttende rum.

Indtil dette punkt har den metodologiske paradigme af live-cell fluorescensmikroskopi stort set været at mærke proteiner og spore deres placeringer i cellen på særlige tidspunkter med og som regel i to dimensioner. Efterhånden som nye teknologier er begyndt at give eksperimentatorer hidtil uset adgang til submicron skala i levende celler, har den dynamiske arkitektur cytosolen kommer til syne som et nyt og udfordrende grænse for eksperimentel karakterisering. Vi præsenterer en fremgangsmåde til hurtig overvågning af 3D rumlige fordelinger af flere fluorescensmærkede proteiner i gæren cytosolen over tid. 3D timelapse (4D billeddannelse) er ikke blot en teknisk udfordring; rottehende, det fremmer også et dramatisk skift i den konceptuelle rammer, der anvendes til at analysere cellestruktur.

Vi benytter et cytosolisk foldning sensor protein i levende gær til at visualisere forskellige skæbner for fejlfoldede proteiner i cellulær aggregation kvalitetskontrol, ved hjælp af hurtig 4D fluorescerende billeddannelse. The temperaturfølsom mutant af Ubc9 protein ^10-12 (Ubc9 ^ts) er yderst effektivt både som en sensor af cellulær proteostasis, og en fysiologisk model for sporing aggregation kvalitetskontrol. Som med de fleste ts-proteiner, er Ubc9 ^ts fuldt foldet og funktionelt ved permissive temperaturer som følge af aktive cellulære chaperoner. Over 30 ° C, eller når cellen vender misfoldning stress, Ubc9 ^ts misfolds og følger skæbnen for et nativt globulært protein, som er blevet fejlfoldede på grund af mutation, varmedenaturering, eller oxidativ skade. Ved at fusionere det til GFP eller andre fluoroforer, kan det spores i 3D, som den danner Stress Foci, eller er direttet op på JUNQ eller iPod.

Protocol

1. Gær Forberedelser

1. Omdanner gærstammer med et plasmid, der bærer en GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ^ts) kassette.
2. Grow gær i syntetisk medium indeholdende 2% raffinose i 24 timer og igen fortyndet til 2% galactose holdige medier i 16 timer eller O / N. Cellerne inkuberes ved 30 ° C under omrystning ved 200 rpm.
3. Den følgende morgen, fortyndes forespørgslen stamme til _OD600 = 0,2. Omrystes i 4-6 timer ved 30 ° C (200 rpm), indtil kulturen når _OD600 = 0,8 til 1,0.
4. Til at repressere ekspression (for således at overvåge kun den allerede oversat og foldet pulje af GFP-Ubc9 ^ts), ændre mediet til syntetiske medier suppleret med 2% glucose (SD) 30 min før imagografi.
5. Behandling - Heat shock cellerne i 20 minutter ved 37 ° C for at inducere misfoldning, eller kontinuerligt i mikroskop incubator at følge proteinaggregering på varmechok-betingelser. Bemærk - hvis du bruger mikroskopet ved enhver temperatur over RT, forvarme for omkring 2 timer for at ækvilibrere temperaturen langs selve mikroskopet og de mål (se nedenfor).

2. Plate \ Slide Forberedelser

1. Vælg en passende plade. Den vigtigste overvejelse er evnen til at fastholde fokus under billedbehandling købet. Følgende punkter er afgørende for 4D billeddannelse og ikke til 2D tid bortfalder, eller 3D-billedbehandling.
   1. Multiple brønde plade-bunden af de forskellige brønde er ikke homogen (dvs. brøndene vil være i forskellige højder i forhold til målet). Dette vil gøre det vanskeligt at opretholde fokus på tværs xy punkter og tidspunkter, uafhængigt af autofokus-teknik, der anvendes.
   2. Slide materiale: glas vs plast. Glas bund dias er mere z-homogen mellem brønde, men er dyrere.
   3. Tykkelse af pladens bund: vi normalt bruger dækglas-bundplader indeks 1,5, men index 1 er også acceptabelt afhængig af formålet.
2. Covis bunden af ​​pladen \ objektglas med ConA (0,25 mg / ml) i 10 minutter. ConA anvendes til at klæbe celler til objektglasset, som gør det muligt efter en enkelt celle over tid.
3. Fjern ConA og inkubér objektglasset i en kemisk hætte så overskydende ConA vil fordampe.
4. Plade 200 pi gær prøve _(OD600 = 0,5) i ConAed brønd.
5. Inkuber i 15 min, at muliggøre celler klæbe til overfladen af ​​pladen.
6. Ekstraher mediet, og vask tre gange med nyt medium for at få et lag af celler. Bemærk: Hvis en lang tid lapse er planlagt, frø cellerne tyndt, således at nye knopper ikke vil fylde og afbryde området af interesse.

3. Mikroskop Forberedelser

1. Vi bruger et Nikon A1Rsi konfokalt mikroskop med et par ikke-standard modifikationer. For gær billeddannelse vi bruger op til 4 lasere (405 nm, 50 mW CUBE laser; 457-514 nm, 65 mW argonionlaser, 561 nm, 50 mW Sapphire laser; og 640 nm, 40 mW CUBE laser), og op til 4 PMT'er udstyret medfiltre. De fleste af vores imaging sker med et grønt filter sæt til EGFP og en rød filter sæt til mCherry og tdTomato. Med GFP og mCherry der er næsten ingen bleedthrough, derfor bruger vi ofte samtidig scanning. Imidlertid kan line-scanning også anvendes til at forhindre bleedthrough, når den forekommer. Vores konfokal er også udstyret med en PInano Piezo tidspunkt (MCL), hvilket kan gøre 3 ms trin i z, så 2-3 z-stakke (30-50 sektioner) per sekund. Systemerne har også en spektral detektor, Perfect Focus (laser offset), og to scannere - en galvanisk scanner og en resonant scanner.
2. Vælg passende mål. Vigtigste overvejelser:
   1. Vand / olie / luft mål: den vigtigste overvejelse er brydningsindekset for det billeddannende medie vs mediet af prøven.
      1. Olie objektive fordele:
         1. Olie målsætninger kan have højere numeriske åbninger (olie pauser lys mere end vand, og derfor flere fotoner gå tilbage til målet). Olie målsætninger kan have optil NA 1,49, sammenlignet med 1,27 for vand. (Men det er faktisk ikke en enorm forskel i opløsning).
         2. Brydningsindekset for olien matcher brydningsindekset for glas, derfor ingen fotoner mistes går fra prøven, gennem glasset, til målet. (Bemærk - valgte en immersionsolie der har et brydningsindeks, der passer til dit mål og din dækglas).
         3. Olie muliggør problemfri lang time-bortfalder, da det ikke fordamper.
         Olie Mål ulemper:
         1. Den højere opløsning aktiveret af den højere NA af olie mål nedbrydes hurtigt når lyset skal bevæge sig gennem et vandigt medium (såsom en celle).
         2. Billeder har typisk mere sfæriske aberrationer og en "strakt ud"-effekt i 3D.
         3. Olie er klistret, rodet, og en fare for målene.
      2. Vand objektive fordele
         1. Cellen selv er vandig, derfor er der færre forvridninger i Z, And resolutionen fortsat høj dybt i en vandig prøve.
         2. Rens og brugervenligt. Vand objektive ulemper: fordamper hurtigt, derfor ikke velegnet til lange film uden særlige arrangementer der gøres for at pumpe vand kontinuerligt til målet.
      3. Air objektive fordele: 1. Intet materiale er tabt / fordamper i løbet af flerpunkts erhvervelse eller en lang film. 2. Rens og brugervenligt. Ulempe: lav opløsning og lav signal følsomhed.
   2. Værelse og inkubator temperatur: skiftende temperatur påvirker stof egenskaber, og i sarte systemer ændrer fokus. Temperaturen bør justeres, før du vælger point for erhvervelsen. Ændring af temperaturen i forbindelse med opkøb vil forstyrre billeddannelse og vil resultere i tab af fokus. Vi lader vores mikroskopsystem ligevægt i 2 timer ved den ønskede temperatur, før billeddannelse.
   3. Korrektionsfaktorer kraver: Mange mål kommer med en korrektion ring gør det muligtdet mål, der skal justeres for en given dækglas tykkelse. Vi anbefaler tilpasning af korrektionen kraven under brug fluorescerende perler at visualisere punktspredningsfunktionen. Dette vil sikre korrekte indstillinger for hver prøve.
   4. Stabile prøveholdere: Vi finder, at de fleste kommercielt tilgængelige prøveholdere er den svageste del af mikroskopet. De er ofte vaklende og ikke lige. Det er en katastrofe for høj opløsning, multi-point 4D billeddannelse. Vi designer vores egne prøveholdere, der er lige og passe stramt på scenen. De kan også boltes ned efter behov.
   5. Multi-point opkøb: vores imaging system er udstyret med Nikons "Perfect fokus"-system, som er dybest set en laser-baseret autofokus mekanisme. Men autofokusering er ikke nødvendigvis nødvendigt med 4D billeddannelse, især hvis systemet ikke glider meget.

4. Imaging

1. Tænd for systemet: lasere, scene, controller, kamera og computer software.
2. Placer pladen på scenen holder, behørigt fastspændt og stabiliseret.
3. Brug eye port til at bestemme placeringen og orienteringen af ​​gær.
4. Ved hjælp af lysfelt, celle sundhed og levedygtighed vurdere efter disses form og tekstur.
5. Tænd epifluorescerende lys i henhold til den relevante fluorofor (fx FITC-filter for GFP), og fokusere på celler, som viser fænotype, som er genstand for din forskning. Celler, som er stærkt fluorescerende i mere end én bølgelængde kan være døde og derfor autofluorescerende. Vi visualisere kernen med en tdTomato fluorofor fusioneret til en SV40 NLS signal (NLS-TFP). TFP er dobbelt så stor som GFP, og er derfor over diffusion grænse af kernen, derfor fungerer udmærket som en nuklear markør. Vi kan også vække TFP med en grøn (488 nm) laser samtidigt som GFP, men indsamle de grønne og røde emissioner i to separate PMT'er til spektral opløsning.
6. Juster følgende indstillinger for at minimere støjog overmætning:
   1. Laser effekt - fotoblegning og fototoksicitet vs lysstyrke af billedet bør overvejes.
   2. Gain: påvirker kameraets følsomhed, og dermed signal støjforhold.
   3. Pinhole diameter - bør justeres i overensstemmelse med laseren med den kortere bølgelængde. Pinhole diameter bestemmer tykkelsen (højden) af den optiske sektion afbildes. Således vil åbningen af ​​pinhole indsamle mere lys (lad flere fotoner i), men vil aftage opløsning i z (mindre confocality).
7. Nyttige tips:
   1. Hvis forskellige fluoroforer udsender kongruent bølgelængde, skal du bruge Spectral Detector funktion, som gør det muligt at valget af virtuelle filtre. Husk på, at spektrale detektorer er mindre følsomme end almindelige PMT'er.
   2. Hvis forskellige fluoroforer er begejstrede af den samme laser, bruger linjen scanning funktion.
   3. En Galvano scanner muliggør mere følsomhed, men har en højere risiko for fotoblegning. Et Resonant scanner muliggør hurtigere encquisition, derved mindske risikoen for fotoblegning, men er mindre følsom.
   4. Gennemsnit mellem 2 og 16 billeder, det øger signal-støjforholdet, men akkvisition langsommere og naturligvis indebærer mere eksponering af prøven til laseren.
   5. Varighed af overtagelsen afhænger af den biologiske spørgsmål (f.eks JUNQ og IPOD dannelse tager ~ 2 timer). Vi har afbildes gær med den resonante scanner for op til 30 timer i 3D time-lapse.
   6. Time Lapse intervaller-mindre intervaller vil skabe et mere sammenhængende film, men kan forårsage foto blegning og dermed tab af signal.

Representative Results

Figur 1. Model:. Sub-cellulær opdeling af fejlfoldede proteiner Kvalitetskontrol maskiner dirigerer fejlfoldede proteiner i distinkte rum med forskellige funktioner: opløselige proteiner, der er målrettet til nedbrydning, gennemgå poly-ubiquitinering og sendes til Ju XTA-N uclear Q VALITET kontrol rum (JUNQ ). Uopløselige proteiner, der ikke kan ubiquitinerede sendes til beskyttende binding til I nsoluble Pr otein D eposit (iPod), der støder op til vakuolen, hvor de gennemgår aktive aggregering.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg "/>
Figur 2. Modeling protein fejlfoldning med GFP-Ubc9 ^ts. Under normale forhold er GFP-Ubc9 ^ts (grøn) oprindeligt foldet, og er lokaliseret diffust i kernen og i cytosolen. Kernen mærkes af NLS-TFP (rød). Ekspression af Ubc9 ^ts blev slukket ved tilsætning af 2% glucose før billeddannelse i alle forsøg. Klik her for at se større figur .

1. Ved temperaturskift til 37 ° C, GFP-Ubc9 ^ts (grøn) fejlfoldede og danner cytosolisk Stress Foci. Kernen mærkes af NLS-TFP (rød).
2. Efter genvinding fra varmechok ved 23 ° C, det termisk denatureret GFP-Ubc9 ^ts nedbrydes, som angivet ved faldet fluorescensniveau.
3. Ved temperaturskift til 37 ° C og proteasomhæmning med 80 mM MG132, GFP-U bc9 ^ts er fejlfoldede og forarbejdes til JUNQ og IPOD optagelser. Kernen mærkes af NLS-TFP (rød).
4. Ved temperaturskift til 37 ° C og ubiquitinering inhibering, er GFP-Ubc9 ^ts fejlfoldede og forarbejdes til IPOD integration. Kernen mærkes af NLS-TFP (rød). Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) overudtrykkes til blok Ubc9 ^ts ubiquitinering.

Figur 3. Tidsforløb på JUNQ og IPOD formation. Ved temperatur skift til 37 ° C og proteasomhæmning med 80 mm MG132 er GFP-Ubc9 ^ts Stress Foci forarbejdet til JUNQ og IPOD optagelser. Kernen mærkes af NLS-TFP (rød). 3D-billeder blev erhvervet ved 4 minutters intervaller. (Se også Movie 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Discussion

Vores intuition om biokemiske processer stammer fra bordpladen forsøg, hvor et velblandet opløsning af reaktanter og produkter får lov til at nå ligevægt i et bæger. I en sådan indstilling, kan koncentrationen af ​​en given kemisk stof udtrykkes som et enkelt tal, som er forholdet mellem en molær kvantitet af molekyler til en makroskopisk volumen. Meget af hvad vi ved om proteiners struktur og funktion stammer fra brug af metoder, der afspejler den klassiske, bulk reaktion billede: western blots, centrifugeringer og spektrofotometriske måling, der gennemføres på ekstrakter fra homogenater af hele populationer af celler.

Som den teknologi, vi bruger til at se på celler under forstørrelse forbedres med stormskridt, bliver det stadig tydeligere, at de betingelser, hvorunder de fleste biokemiske reaktioner finder sted in vivo kun bærer den mindste lighed med bestemmelserne i det klassiske bænk top scenario. Ikke alene er det indre af cella tætpakkede miljø, hvor fortrængning virkning markant påvirke aktiviteterne af forskellige reaktanter, er det også det modsatte omhyggeligt blandet. Dette forklarer den hyppige forskel mellem in vitro-og in vivo-effektiviteten af en lang række komplekse makromolekylære reaktioner.

Intetsteds er intuitioner stammer fra klassisk in vitro biokemiske eksperimenter mere tilbøjelige til at vildlede som i spørgsmål vedrørende den in vivo, forkert foldning, og aggregering af proteiner. Henviser til studier af proteinkemi, bulk reaktioner kan behandle spørgsmålet om foldning for et givet protein som en simpel ja eller nej spørgsmål, skal ethvert forsøg på at spore dynamikken i hele populationer af makromolekyler i en levende celle være følsomme over hele fordelingen af ​​mulige konformationelle resultater tilgængelige for en polypeptidkæde, og især risikoen for misfoldning og aggregering. For eksempel kan vi undersøge en bulk celle lykompensere for et aggregerende protein ved western blotting, og bestemme, at proteinet er hovedsagelig uopløseligt eller ikke-ubiquitineret. Men i den levende celle en diskret subpopulation af proteinet, vanskelige at detektere, når gennemsnittet over mange celler, kan være opløselige og ubiquitineret i et bestemt segment, hvor den lokale koncentration af arterne er ekstremt høj. Sidstnævnte scenario kan have mere alvorlige konsekvenser for levedygtigheden af ​​cellen end den større bulk-delpopulation. Endvidere henviser chaperoner vise en lang række pleiotrope adfærd og funktioner in vitro, bliver det mere tydeligt, at i cellen deres diskrete funktioner er rumligt og tidsmæssigt begrænset.

I trit med den nye paradigme for forståelsen biokemi, bliver koncentrationen et variabelt egenskab ved hver specifik nano-miljø i cellen, og de molekylære begivenheder, der ligger til grund biologiske processer skal analyseres, ikke blot i tid, men også i Space. 4D billeddannende fremgangsmåde præsenteres her muliggør følsom modellering af protein fejlfoldning i levende celler, selv om det kan anvendes til at undersøge en række andre biologiske processer, og hvordan de er reguleret i rum og tid, og efter ændringer i miljømæssige betingelser. I dette papir, vi bruger Ubc9 ^ts folde sensor, der effektivt demonstrerer de faser og muligheder for behandling med debut af proteinaggregering i cytosolen. Ud over at der illustrerer cellebiologien af aggregering kvalitetskontrol, kan denne fremgangsmåde anvendes som et effektivt værktøj til dechifrering virkningen af specifikke forstyrrelser eller genetiske mutationer på proteostasis (f.eks Ubc9 ^ts kan anvendes til at måle proteinfoldning stress som oxidation, ekspressionen af ​​et toksisk aggregat, eller mutationer i kvalitetskontrol pathway).

4D billeddannelse er også afgørende for nøjagtigt at bestemme protein lokalisering eller colokalisering mellem to forskellige proteins, og til påvisning af fænomener, som måske være forbigående, men vigtige. For eksempel, især i en lille sfærisk organisme såsom gær kan det synes at være tilfældet, at en struktur eller aggregat har juxtanuclear lokalisering, mens 4D billeddannelse kan afsløre, at dette er blot en artefakt af vinklen for inspektion.

I eksemplet eksperiment vi her, viser vi anvendelse af en model misfoldet protein, Ubc9 ^ts, at følge aggregation kvalitetskontrol over tid og rum i cytosolen. Ved den permissive temperatur, er Ubc9 ^ts foldet og spredes i kernen og cytosol. Ved varmeinduceret misfoldning, i første omgang danner hurtigt spredende små samlede Stress Foci, der behandles for proteasomalaktivitet nedbrydning. Når proteasomet er delvis inhiberes, er disse Stress Foci omdannes til JUNQ og IPOD inklusioner i løbet af ca 2 timer. Hvis ubiquitinmedieret nedbrydning ikke er tilgængelig som en kvalitetskontrol option, UbC9 ^ts straks omdirigeret til iPod integration for beskyttende aggregering. Disse værktøjer tilbyder utrolige muligheder for at opdage nye genetiske faktorer involveret i aggregation kvalitetskontrol, og til at udforske deres rumlige og tidsmæssige regulering i cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Glass bottom plates	ibidi	ibd81158
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.