Summary
Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.
Abstract
Zoogdieren testes zijn zeer complexe organen die meer dan 30 verschillende soorten cellen, waaronder somatische testiculaire cellen en de verschillende stadia van germlinecellen bevatten. Deze heterogeniteit is een belangrijk nadeel met betrekking tot de studie van de grondslagen van zoogdieren spermatogenese, zoals zuivere of verrijkte celpopulaties in bepaalde stadia van spermaontwikkeling nodig voor twee moleculaire analyses 1.
Verschillende strategieën zoals Staput 2,3 centrifugale elutriatie 1 en flowcytometrie (FC) 4,5 zijn gebruikt om verrijkte of gezuiverde celpopulaties testicular verkrijgen om differentiële genexpressie studies mogelijk.
Het is vereist dat cellen in suspensie meeste verrijking / zuivering benaderingen. Idealiter zal de celsuspensie vertegenwoordiger van het oorspronkelijke weefsel, een hoog percentage levensvatbare cellen en enkele multinucleates - die meestal gevormd door desyncytieel aard van de seminifereus epitheel 6,7 - en gebrek celklonten 1. Eerdere rapporten had aangetoond dat testiculaire celsuspensies bereid door een uitsluitend mechanische methode samengeklonterd gemakkelijker dan getrypsiniseerde degenen 1. Anderzijds, enzymatische behandelingen met RNAsen en / of disaggregeren enzymen zoals trypsine en collagenase leiden tot specifieke macromoleculen afbraak, hetgeen ongewenst is voor bepaalde verdere toepassingen. De ideale proces moet zo kort mogelijk zijn en op minimaal manipulatie, teneinde een goede bewaring van macromoleculen plaats zoals mRNA bereiken. Huidige protocollen voor de bereiding van celsuspensies van vaste weefsels gewoonlijk tijdrovend, sterk afhankelijk van de operator, en kunnen selectief beschadigen bepaalde celtypen 1,8.
De hier gepresenteerde protocol combineert de voordelen van een zeer reproduceerbare en uiterst korte mechanische disaggregatie met eenbsence enzymatische behandeling, wat leidt tot goede kwaliteit celsuspensies die kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse en sortering 4 en latere genexpressiestudies 9.
Protocol
1. Bereiding van celsuspensies
- Offeren het monster te gebruiken naar aanleiding van de aanbevelingen van de gespecialiseerde commissies, zoals IACUC of gelijkwaardig (in Uruguay, de Nationale Commissie voor Dierproeven [CNEA]). In ons geval werd een overdosis pentobarbital toegediend.
- Ontleden de testes volgens standaard goedgekeurde procedures en plaats ze in een 96 mm glazen petrischaal op ijs, met 10 ml ijskoude DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum.
- Verwijder de tunicaalbuginea en snijd de gedecapsuleerde testes in vierkante stukjes van 2 - 3 mm aan elke kant.
- Deze stukken worden vervolgens in een Medimachine, een geautomatiseerde mechanische maalinrichting waarbij het weefsel wordt opgesplitst in een wegwerpbare eenheid een geperforeerde roestvrij stalen scherm en een metalen rotor. Om dit te doen, plaats 1 ml koude aangevuld DMEM en 4-5 van deze stukken in een 50 um wegwerpeenheid, schakel de disaggregator en proces voor 50 sec na de eenvoudige instructies van de fabrikant.
- Herstellen van de resulterende celsuspensie uit de opsplitsing apparaat met behulp van een 3 - 5 ml spuit zonder naald.
- Filtreer door een 50 um nylon, eerder gedrenkt met 0,5 ml DMEM aangevuld.
- Weer Filter de suspensie op met een doorweekte 25 pm nylon, en plaats op ijs.
- Tellen in een Neubauer kamer en cellulaire concentratie aan te passen aan 1 - 2 x 10 7 cellen / ml met DMEM aangevuld. Ten minste 4 x 10 7 cellen / gram testis materiaal worden gewoonlijk verkregen.
- Voeg tenslotte NDA (2-naftol-6 ,8-disulfonzuur, dikaliumzout) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% om cel klonteren te voorkomen.
- Optioneel: check levensvatbaarheid van de cellen van de testis cel suspensies met een commercieel verkrijgbaar levensvatbaarheid kit voor dierlijke cellen, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Flowcytometrische Analyse
ve_content "> We hebben een Becton-Dickinson FACSVantage flowcytometer met een Coherent argon ion laser afgestemd emitteren bij 488 nm voor de analyse van cellen gekleurd met hoge concentraties van propidiumjodide (PI) worden gebruikt. (De kwestie van PI entree in gefixeerde cellen onder stress is elders 9,10 aangepakt).- Voor PI kleuring voeg fluorochroom bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml van de celsuspensie en incubeer gedurende 10 min bij 0 ° C in het donker.
- Laservermogen is ingesteld op 100 mW en een 575/26 band pass filter wordt gebruikt om de PI-geëmitteerde fluorescentie te verzamelen in FL2.
- We voeren FC metingen met een 70 um mondstuk. Voor het sorteren spermatocyt bevolking, ingesteld sorteren modus Normal-R of Normal-C, met 3 naargelang druppels als envelop. Houd monster en collectie buizen op 3 - 4 ° C met behulp van een koelunit. Pas monster differentiële om cellen te analyseren met een snelheid van 500 tot 1500 per seconde.
- Gebruik CellQuest software (BD) te analyserende volgende parameters: voorwaartse verstrooiing (FSC-H), zijwaartse verstrooiing (SSC-H); totaal uitgezonden fluorescentie of pulse-gebied (FL2-A), en de duur van de fluorescentie-emissie of pulse-width (FL2-W).
Als alternatief hebben we de vitale kleurstof Hoechst 33342 toegepast om een uiteindelijke concentratie van 5 ug / ml en gedurende 10 min bij 37 ° C in het donker. Cell analyse werd uitgevoerd door middel van een MoFlo cytometer (DakoCytomation) met een UV excitatie golflengte laser ingesteld op 25 mW en met een 70 um nozzle. Data manipulatie werd uitgevoerd met Summit v4.3 software (DakoCytomation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van een goed opgesplitste celsuspensie van rattentestikels bereid met de hier beschreven protocol wordt getoond in figuur 1.
In vergelijking met enzymatische behandelingen 6,8 en eerder beschreven mechanische uitsplitsing methoden 2, de ene hier gepresenteerde is veel sneller, gaat minder handling, is gemakkelijk reproduceerbaar (niet afhankelijk van de operator), en maakt schaarse celbrokstukken (vooral in vergelijking met andere mechanische methoden) en zeer weinig multinucleates (die zijn beschreven te vormen als gevolg van uitgebreid weefselmanipulatie 1,2). Bovendien, in tegenstelling tot enzymatische behandelingen, vermijdt het gebruik van RNAses, trypsine en collagenase, dat macromoleculen kunnen bevorderen degradatie.
Anderzijds, hoewel eerdere rapporten heeft aangetoond dat testiculaire celsuspensies bereid door een uitsluitend mechanische methode samengeklonterd gemakkelijker dan trypsine opes 1, de toepassing van de onderhavige werkwijze rendered weinig klonteren in de cellulaire suspensies, zoals te zien in figuur 1. In die zin zijn we vonden de opname van NDA zeer efficiënt bij het voorkomen cel klonteren en vermijden mondstuk verstopt raken daaropvolgende stroom studies. Figuur 1 toont ook de schaarste van celresten, die ook duidelijk in de FC histogrammen weergegeven in figuur 2.
Trouwens, cel suspensies bereid met deze methode tonen een adequate vertegenwoordiging van de verschillende testiculaire celtypen. Dit werd door het vergelijken van de cellulaire samenstelling van testiculaire celsuspensies bereid volgens de werkwijze hier gepresenteerd gerapporteerde gegevens van cel tellingen in dwarsdoorsnede van testes gesloten, en celsuspensies bereid met ook andere (tabel 1).
FC histogrammen verkregen suspensies bereid door de present protocol en gekleurd of met Hoechst 33342 (Figuur 2A) of PI (Figuur 2B) niet wezenlijk verschilt van eerder gerapporteerde degenen 8, ook het ondersteunen van de veronderstelling dat de procedure niet selectief beschadigt specifiek celtype.
| Testicular celtypen basis van DNA-inhoud | Intact testis a (%) | Medimachine - bereide suspensies b (%) | Getrypsiniseerde schorsingen a (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17,9 | 18.7 | 8.7 |
| Anderen | - | - | 4.6 |
| B) Cavia rood | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| een cel tellingen werden beoordeeld door microscopische waarneming. b celtellingen werden door stroomcytometrie. | |||
Tabel 1. Relatieve percentages van volwassen testiculaire cel populaties verschillen in hun DNA inhoud van celsuspensies van muis (A) en cavia (B) bereid wordt door de onderhavige methode in vergelijking met intacte testis en - voor muizen - to trypsine-bereide suspensies (Modified van Geisinger en Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010)). Inhoud DNA zijn: C (rond en elongating spermatiden, spermatozoa), 2C (testiculaire somatische cellen, spermatogonia, secundaire spermatocyten), en 4C (primaire spermatocyten en enkele delende spermatogonia in G2 fase).
Figuur 1. Gedeeltelijke weergave van een celsuspensie van volwassen rat testis opgesteld door het huidige protocol en gevisualiseerd door fasecontrastmicroscopie. Zoals te zien is, zijn cel cytoplasma goed bewaard gebleven. De balk correspondeert met 25 urn. Overgenomen van Rodríguez-Casuriaga, et al.., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Figuur 2. FC DNA inhoudelijke analyse van testiculaire celsuspensies van volwassen ratten, muizen, cavia's, en van 21 dagen post partum (dpp) ratten, gekleurd met de vitale kleurstof Hoechst 33342 (A) of PI (B). In alle gevallen C, 2C en 4C celpopulaties kunnen eenvoudig worden opgenomen in de histogrammen verkregen met beide kleurstoffen, alsmede de schijnbaar sub-haploïde piek links van de C populatie. Deze laatste piek is aangetoond dat de spermatozoa, die als afzonderlijke, minder gekleurd subpopulatie vanwege hun gecondenseerde chromatine toestand 12 bevatten. Let op de schaarste van puin in alle graphics. Dit is vooral duidelijk in de 21 DPP (juveniele exemplaren) profielen, die spermatiden en spermatozoa missen. Gewijzigd van Geisinger en Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. 4C celpopulatie gesorteerd uit testicular celsuspensie van volwassen ratten. Gesorteerd cellen werden aangebracht op schone poly-L-lysine-behandelde slides en bekeken onder fasecontrast-microscopie (A) of helder veld na Giemsa kleuring (B). Bar = 20 urn. Overgenomen uit Geisinger en Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. Figuur 4 A) FC analyse van een volwassen cavia testis celsuspensie bereid met de hier beschreven protocol (a), histogram;. (B), dot plot. Let op de twee subpopulaties in de 4C celpopulatie. B) Analyse van gesorteerde cellen van R3 4C (a, b) en R4 (a ', b') gebieden. (A, a '), Epifluorescentie microscoopbeelden van PI-gekleurde cellen . Merk op dat de kernen van R3 regio zijn relatief kleiner. Bar: 10 micrometer (b, b '), Laser confocale microscopie van immuuncytochemische reacties op verspreiding cellen met behulp van een antilichaam tegen Sycp3 (Synaptonemal complex [SC] eiwit 3, een zijdelingse component element).. De foto laat de conclusie dat R3 gedeelte komt overeen met vroege (lepto / zygotene) meiocytes, waarin eenvoudige bijlen en korte stukjes van SC's kan worden gezien, terwijl de R4 bevat pachytene meiocytes, met comvolledig geassembleerde SC. Gewijzigd ten opzichte van Rodríguez-Casuriaga, et al.., Cytometry A. 79, 625 (2011). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. A) Agarose gel elektroforese van totaal RNA geëxtraheerd uit spermatogenese stroming gesorteerd celfracties 2C, R3 en R4 (uitleg de laatste twee fracties is in figuur 4). Cel suspensies werden bereid met de hier beschreven protocol. B) Autoradiogram van een denaturerende polyacrylamide elektroforese gel die differentieel cDNA banden verkregen met de "mRNA differential display" methode (RNAimage, GenHunter Corporation, Nashville, TN) een van de primer combinaties uit de set. mRNA van dezelfde drie celpopulaties zoals in
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geoptimaliseerde hier beschreven methode maakt de bereiding van celsuspensies van knaagdieren testisweefsel in een zeer snelle en reproduceerbare wijze voorkomen enzym en detergensbehandeling en onderhouden goede celintegriteit en soort verhoudingen. De korte duur van de procedure (de 15 min overspanning omvat testis dissectie, weefsel snijdende en verwerking), minimaal hanteren van toepassing en geen enzymatische behandelingen zijn enkele van de belangrijkste voordelen. Al deze goed zijn voor de goede conservering van de korte levensduur macromoleculen, wat essentieel is wanneer een representatieve steekproef van verbindingen die in het origineel celpopulatie vereist.
Wat het gebruik van hetzij PI of Hoechst 33342, hebben we geen duidelijke verschillen in profielen gevolg van flowcytometrische analyse van testiculaire celsuspensies met toepassing van een of andere kleurstof waargenomen. De kleurstof keuze zal eerder afhangen voorkeuren en beschikbaarheid van de gebruiker, enop geplande verdere gebruik. Enerzijds PI is goedkoper, en wijdverbreide toepassing als geen gebruik van flowcytometers en sorters met een UV laser vereist. Anderzijds, hoewel we met succes hebben gebruikt PI-gekleurde cellen tot verdere sortering en differentiële genexpressie studies (Figuur 4), Hoechst 33342 of andere vitale kleurstof met een lage cytotoxiciteit niveaus kan de voorkeur keuzes voor omstandigheden de volledige cellevensvatbaarheid vereist, zoals kiem celkweek en / of transplantatie 4.
We zijn in staat om specifieke celpopulaties te bereiken van meer dan 95% zuiver of voor geselecteerde testicular populaties met verschillende DNA-gehalte 4 (figuur 3) sorteren zijn, of zelfs subpopulaties met dezelfde DNA inhoud maar verschillende chromatine condensatie niveaus (figuur 4). Dit laatste kan worden bereikt zolang de subpopulaties plaats worden gegroepeerd in de cytometrische profielen particularly in de puntdiagrammen. Bijvoorbeeld, tot nu toe hebben we in staat geweest om verschillende stadia van cavia meiocytes ik 9 sorteren, maar niet te discrimineren en te sorteren subpopulaties binnen de 2C bevolking gewoon door kleuring van het DNA. Gesorteerd cellen goede kwaliteit RNA gesmolten, waardoor stroomafwaarts differentiële genexpressie analyses 9 (Figuur 5).
Zoals blijkt uit de beschrijving protocol, is het zeer eenvoudig en gemakkelijk reproduceerbaar en niet speciaal geschoold personeel nodig. We beschouwen kan voor allerlei toepassingen waarbij flowcytometrie of niet aangenomen. De voormalige variëren van eenvoudige testiculaire inhoudsanalyse voor de snelle controle van spermatogene vooraf, om anderen met preparatieve streeft zoals stroom zuivering van specifieke celpopulaties voor heimelijke moleculaire studies, zoals hier getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door CSIC (I + D project C022) en PEDECIBA. De auteurs willen Mariela Bollati en Valentina Porro bedanken van de Celbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) voor hun genereuze medewerking betreffende het MoFlo celsorteerder, en Merial-Montevideo voor zacht verstrekken van alle cavia exemplaren gebruikt in dit project. Figuur 1 werd gereproduceerd met toestemming van Biomed Central, figuren 2 en 3, en tabel 1 met toestemming van S. Karger AG, Basel, en de figuren 4 en 5 werden gereproduceerd of aangepast met toestemming van John Wiley & Sons, Inc (copyright in handen van Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
