Summary
睾丸细胞悬浮液从啮齿动物材料，避免酶和洗涤剂，机械制备一种新的协议进行说明。方法很简单，速度快，重复性好，并呈现良好的品质，这是适合流式分选和RNA提取的细胞悬液。
Abstract
哺乳动物睾丸是非常复杂的器官，包含超过30种不同类型的细胞，包括体睾丸细胞和生殖细胞的不同阶段。这种异质性是一个重要的缺点，关于哺乳动物精子发生的研究的基础，作为纯的或富集的细胞群，在精子发育的某些阶段需要1分子分析。
各种策略，如Staput离心淘洗1，2,3，和流式细胞仪（FC）4,5，为了使基因差异表达的研究已获得丰富或纯化睾丸细胞群。
它是必需的细胞是在悬浮液中大多数浓缩/净化方法。理想的情况下，将细胞悬浮液，将代表原始组织，具有高比例的活细胞和少数多核 - 这往往会形成，因为合胞性质的生精上皮6,7 -和缺乏细胞团块。以前的报告已经证明，由一个专门的机械方法编制的睾丸细胞悬液成群更容易比胰酶消化1。另一方面，酶的RNA酶处理的和/或分解的酶，如胰蛋白酶和胶原酶导致特定的大分子的降解，这是不希望的目标的下游应用。理想的过程中应尽可能短，涉及最少的操作，从而实现了良好的保存大分子的利益，如基因。目前的协议，从固体组织细胞悬液的制备通常费时，高度取决于运营商，并且可以选择性地破坏某些类型的细胞1,8。
这里介绍的协议结合了高度重复性和极其短暂的机械分解的优势酶处理bsence，导致以良好的品质，可以用于流式细胞仪分析和分选4，不可告人的基因表达研究9的细胞悬浮液。
Protocol
1。细胞悬液的制备
- IACUC或同等专业委员会（乌拉圭全国委员会动物实验的建议使用牺牲标本[CNEA）。在我们的情况下，过量的巴比妥给药。
- 解剖睾丸标准批准程序后，将它们放置在一个96毫米的玻璃培养皿上冰，冰冷的DMEM含10毫升辅以10％胎牛血清。
- 删除白膜和削减解封的睾丸，每侧的2 - 3毫米见方的小块。
- 然后，这些碎片被处理在Medimachine，自动机械粉碎机组织里面含有穿孔的不锈钢屏幕和金属转子一次性单位分类。要做到这一点，将1毫升冷补充DMEM和4 - 5这些作品在一个50微米的可支配单位，开关disaggregator，和过程 50秒后，从制造商的简单说明。
- 回收得到的细胞悬浮液从分解单元，使用3 - 5毫升注射器不带针。
- 过滤50微米的尼龙网，用0.5毫升浸泡补充DMEM。
- 再次过滤悬浮液浸泡25微米尼龙网，置于冰上。
- 计数在纽鲍室，并调节细胞浓度为1 - 2×10 7个细胞/ ml的DMEM培养液补充。至少为4×10 7个细胞/克睾丸材料是通常获得。
- 最后，添加NDA（2 - 萘酚-6,8 - 二磺酸二钾盐）至终浓度为0.2％，以防止细胞聚集。
- 与市售的动物细胞的生存能力套件可选：检查睾丸细胞悬液的细胞活力，按照制造商的说明。
2。流式细胞仪分析
ve_content“>我们已经使用了流式细胞 - 迪金森FACSVantage流式细胞仪配备调谐发射波长为488 nm的用于分析的细胞与高浓度的碘化丙啶（PI）染色与相干的氩离子激光（未定影的PI的入口进入的问题。细胞在压力下已经解决别处9,10）。- PI染色，在终浓度为50μg/ ml的细胞悬浮液中添加荧光染料，孵育10分钟，在0℃下在黑暗中。
- 激光功率设定为100毫瓦和一个26分之575的带通滤波器是用来收集PI发出的荧光在丙级。
- 我们执行FC测量一个70微米的喷嘴。排序精母细胞群体，在正常-R或-C正常排序模式，使用3排序滴在信封。样品和收集管保持在3 - 4℃，使用制冷机组。调整样品的差来分析细胞的速度为500〜1500，每秒。
- 使用分析应用CellQuest软件（BD）以下参数：前向散射（FSC-H），侧向散射光（SSC-H），总发射的荧光或脉冲面积（FL2-A）和荧光发射的持续时间或脉冲宽度（FL2-W）。
或者，我们所采用的重要染料Hoechst 33342至终浓度为5微克/毫升，并温育10分钟，在37℃下在黑暗中。进行细胞分析装置的一个：流式细胞仪MoFlo（DakoCytomation）配备在25毫瓦的UV激发波长激光器的工作，使用70微米的喷嘴。数据操作进行与峰会V4.3的软件（DakoCytomation）。
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Representative Results
以及分列的细胞悬浮液从大鼠睾丸制备与这里描述的协议的一个例子是图1中所示。
在酶处理6,8和前面描述的机械分解方法2相比，这里介绍的是速度更快，处理涉及较少，很容易重现（取决于运营商），并呈现稀缺的细胞碎片（特别是相对于其它机械方法）和非常少的多核（已经描述了形成作为广泛的组织操纵1,2的结果）。此外，由于相对于酶处理，它避免了使用RNA酶，胰蛋白酶和胶原酶，可能有利于大分子降解。
另一方面，虽然以前的报告已经证明，由一个专门的机械方法编制的睾丸细胞悬液成群更容易比胰酶消化上课1，应用本发明方法所提供的非常小的聚集的细胞悬浮液中，在图1中可以看出。在这个意义上说，我们已经发现NDA列入非常有效的防止细胞聚集，并避免在随后的流的研究喷嘴堵塞， 图1还表明细胞碎片的稀缺性，这也是明显的，在图2中所示的FC直方图。
此外，用这种方法制备的细胞悬液充分代表不同的睾丸细胞类型。得出的结论进行比较，这里介绍的方法从细胞计数中的生精小管的横截面的数据报的睾丸细胞制备的悬浮液的细胞的组合物，并制备细胞悬浮液，以及使用其他方法（ 表1）。
FC直方图得到悬浮液由预选nt的协议和染色用Hoechst 33342（ 图2A）或PI（ 图2B）基本上没有不同于先前报道的8，也支持该过程不假设任何特定的细胞类型选择性地损坏。
| 基于DNA含量的睾丸细胞类型 | 完好睾丸（％） | 准备Medimachine -悬浮B（％） | 胰酶消化悬浮液（％） |
| A） 小家鼠 | |||
| Ç | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ TD> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| 他人 | - | - | 4.6 |
| B） 豚鼠porcellus | |||
| Ç | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| 一个细胞计数，通过显微镜观察评估。 B细胞计数流式细胞仪进行了评估。 | |||
表1中。成人睾丸细胞群，其DNA含量不同的细胞悬液从小鼠和豚鼠（A）（B）准备由兹提出的方法相比，完整的睾丸-鼠标的相对百分比- T准备Ø胰蛋白酶的悬浮液（修改从格伊辛格和罗德里格斯Casuriaga的的，细胞遗传学， 基因组住宅 128，46（2010））。 DNA含量为：C（圆形和长形精子细胞，精子），2C（睾丸细胞，精原细胞，次级精母细胞）和4C（初级精母细胞和精原细胞增殖几个在G2期）。
图1。本协议，并编制相衬显微镜观察成年大鼠睾丸细胞悬液。鉴于部分细胞胞质中可以看出，保存完好。酒吧对应到25微米。转载自罗德里格斯Casuriaga， 等。，生物学。程序，。在线11，184（2009）。
图2。 FC DNA含量分析在所有的情况下成年大鼠，小鼠，豚鼠，以及从后21天产后（DPP）幼鼠，染色的重要染料Hoechst 33342（A）或（B）与PI睾丸细胞悬液。 C，2C和4C的细胞群，可以很容易地与两种染料，以及显然子单倍体峰的左侧的C人口中公开获得的直方图。后者的峰已被证明含有精子，显示为一个单独的，减染色的亚群，由于他们的染色质凝集状态12。注意的稀缺性在所有的图形碎片。 21民进党（少年的标本）的型材，缺乏精子细胞和精子，这一点尤其明显。修改从格伊辛格和罗德里格斯Casuriaga的的， 细胞遗传学。基因128，46（2010）。 点击这里查看大图。
图3。 4C细胞群体排序排序从成年鼠的睾丸细胞悬液。细胞沉积到干净的聚L-赖氨酸处理幻灯片和相衬显微镜下姬姆萨染色后（B）（A）或明场观察。酒吧= 20微米。转载从格伊辛格和罗德里格斯Casuriaga的的， 细胞遗传学。基因 128，46（2010）。
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图4 A）FC分析的成年豚鼠睾丸细胞悬浮液与协议描述（一），直方图（b）中 ，积点。请注意，两个亚群B）的分析排序细胞从4C R3（一，二）和R4（如a，b'）的区域（A，A'），落射荧光显微镜图像的PI染色的细胞在图4C的细胞群。 。需要注意的是原子核从R3区域相对较小。酒吧：10微米（B，B'），激光共聚焦显微镜使用的抗体SYCP3蔓延细胞的免疫细胞化学反应（联会复合体[SC]蛋白3，横向元素成分）。图片允许R3分数对应的结论是早期（lepto /偶线），可以看到简单的轴和短绵延的SCS meiocytes，而R4包含粗线期meiocytes，与COM完全组装的SCS。修改罗德里格斯Casuriaga 等，流式细胞仪 79，625（2011）。 点击这里查看大图。
图5。 A）从生精流的排序条件的细胞部分2C，R3和R4（后两个级分的解释是在图4中）中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳，制备细胞悬浮液B）的放射自显影的变性与这里描述的协议。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出差异表达的cDNA带获得通过mRNA差异显示法“（RNAimage GenHunter公司，田纳西州纳什维尔）从试剂盒引物组合之一。基因的细胞群，在从相同的三个
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Discussion
这里描述的优化方法使细胞悬液的制备从啮齿动物睾丸组织在一个非常快速和可重复的方式，避免了酶和洗涤剂处理和维护良好的细胞的完整性和类型比例。的简洁的程序（跨度15分钟包括睾丸切除，组织切割和处理），涉及最少的处理，酶处理的情况下的一些主要优点。所有这些将占短暂的生命大分子保存好，这是关键的时候，具有代表性的化合物存在于原始细胞人口需要。
关于使用PI或赫斯特33342，流式细胞仪分析睾丸细胞悬液的就业或其他染料产生的配置文件中，我们已经观察无明显差异。染料的选择，更取决于用户的喜好和空房，计划进一步利用。的一侧上，PI是便宜的，广泛的应用，不要求使用流式细胞仪和分选机，具有紫外激光。另一方面，虽然我们已经成功地使用PI染色细胞不可告人的排序和基因差异表达的研究（ 图4），赫斯特33342或低毒性水平的另一个重要的染料，可能是最好的选择，应用全细胞活力，如生殖细胞培养和/或移植4。
我们已经能够实现超过95％的纯度，或者与不同的DNA含量4（ 图3）对选定的睾丸人口分类，特定的细胞群，或什至具有相同的的DNA内容，但不同的染色质凝集的水平（ 图4）的亚群。只要感兴趣的亚群可以个性化流式细胞仪的配置文件，后者可以完成，PArticularly点图。举例来说，到现在为止，我们已经能够排序豚鼠meiocytes我9的不同阶段，但不要歧视和排序亚群内2C人口根本染色的DNA。排序细胞提供良好的高质量的RNA，使下游基因差异表达分析（ 图5）。
协议的描述中可以看出，这是很简单的，可容易地复制，并且不需要特别熟练的人员。我们认为，它可以为各种各样的应用，涉及流式细胞仪或不通过。前者的范围从简单的内容分析睾丸生精提前的快速检查，给别人用制备的目的，如流净化出于不可告人的分子生物学研究特定的细胞群，如下图所示。
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Acknowledgments
这部分工作是由中国船舶重工集团公司（I + D项目C022）和PEDECIBA支持。作者要感谢玛丽拉博拉蒂和瓦伦蒂娜普罗图1从细胞生物学部（巴斯德研究所蒙得维的亚）慷慨协作有关MoFlo的细胞分选，轻轻提供在这个项目中使用的所有豚鼠标本梅里亚蒙得维的亚。转载BioMed Central的许可; 图2和图3，表1与许可S.卡格尔AG，巴塞尔和图4和图5分别与约翰·威利父子公司（版权拥有者许可，复制或改编威利-布莱克韦尔，2011）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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