Summary
Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.
Abstract
Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler 1 için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var.
Bu Staput 2,3, santrifüj elutrasyon 1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) 4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır.
Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması - çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri 1 - seminifer epitel 6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar 1'den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi 1,8 zarar verebilir.
Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama 4 ve art gen ekspresyon çalışmaları 9 için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.
Protocol
1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması
- Bu IACUC veya eşdeğeri olarak özel komitelerin önerileri takip kullanılacak örnek Sacrifice (Uruguay, Ulusal Komisyonu Hayvan Deney için [CNEA]). Bizim durumumuzda, pentobarbital aşırı dozda uygulandı.
- Onaylı Standart prosedürler takip testis ayır ve buz gibi soğuk 10 mi DMEM içeren, buz üzerinde bir 96 mm cam petri tabağına yerleştirin,% 10 fetal dana serumu ile desteklenmiştir.
- Tunika albuginea çıkarın ve 2 kare parçalar halinde Decapsulated testis kesmek - Her iki tarafta 3 mm.
- Bu parçalar daha sonra bir Medimachine, doku bir delikli paslanmaz çelik ekran ve bir metal rotor içeren bir tek birim içinde ayrıştırılmış bir otomatik mekanik taşlama işlenir. 50 mikron tek birim, disaggregator açın ve süreç içinde bu parçaları 5 - Bunu yapmak için, soğuk yerine 1 ml DMEM ve 4 takviye üreticisinin basit yönergeleri izleyerek 50 sn.
- Iğne olmadan 5 ml şırınga - 3 kullanarak ayrıştırma ünitesinden çıkan hücre süspansiyonu kurtarın.
- 0.5 ml DMEM takviye ile daha önce ıslatılmış 50 mikron naylon örgü, süzülmeye.
- Bir batırılmış 25 mikron naylon örgü, ve buz üzerinde yer kullanarak tekrar süspansiyon filtre.
- Bir Neubauer odasında saymak ve 1 ile hücresel konsantrasyonu ayarlayın - 2 x 10 7 hücre / ml desteklenmiş DMEM ile. En az 4 x 10 7 hücre / testis malzemesinin gramı Ortalama elde edilir.
- Son olarak, hücre topaklanma önlemek için% 0.2 'lik nihai bir konsantrasyona kadar (2-naftol-6 ,8-disülfonik asit, dipotasyum tuzu) NDA ekleyin.
- İsteğe bağlı: Üreticinin talimatları izleyerek, hayvan hücreleri için bir ticari canlılığı kiti ile testis hücre süspansiyonları hücre canlılığı kontrol edin.
2. Akış Sitometrik Analizi
ve_content "> Biz propidyum iyodür yüksek konsantrasyonlarda (PI) ile lekeli hücrelerin analizi için 488 nm dalga boyunda yayan ayarlı bir Coherent argon iyon lazer ile donatılmış, bir Becton-Dickinson FACSVantage akış sitometresi kullandık. (sabitlenmemiş içine PI giriş sorunu stres altında hücreleri) başka bir yerde 9,10 ele alınmıştır.- PI boyama için, 50 hücre süspansiyonu ug / ml 'lik bir son konsantrasyonda florokrom ekleyin ve 0 ° C'da 10 dakika ° C'de karanlıkta inkübe edin.
- Lazer gücü 100 mW ve 575/26 bant geçiren filtre FL2 PI-yayılan floresan toplamak için kullanılır ayarlanır.
- Biz bir 70 mikron nozul ile FC ölçümleri. Spermatosit nüfus sıralama için, zarf olarak 3 sıralama kriteri damla kullanarak, Normal-R veya Normal-C modunda sıralama ayarlayın. 3 de örnek ve toplama tüpleri tutun - 4 ° C soğutma ünitesi kullanarak. Saniyede 1.500 500 oranında hücreleri analiz etmek için örnek diferansiyel ayarlayın.
- Analiz etmek CellQuest yazılım (BD) kullanınAşağıdaki parametreleri: forward scatter (FSC-H); tarafında dağılım (SSC-H), toplam yayılan floresan veya darbe alan (FL2-A) ve floresan emisyon veya darbe genişliği (FL2-W) süresi.
Alternatif olarak, 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar önemli bir boya Hoechst 33342 kullanılan ve 37 dakika 10 ° C'de karanlıkta inkübe var. Hücre analizi bir MoFlo Sitometreyi (DakoCytomation) aracılığıyla 25 mW bir UV dalgaboyu lazer çalışma ile donatılmış ve 70 mikron nozul kullanılarak yapılmıştır. Veri işleme Zirvesi v4.3 yazılımı (DakoCytomation) ile yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen protokol ile hazırlanan fare testis, iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonu, bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.
Enzimatik tedavi 6,8 ve daha önce açıklanan mekanik ayrıştırma yöntemleri 2 ile karşılaştırıldığında, burada sunulan bir (özellikle diğer mekanik göre, çok daha hızlı daha az işleme içerir, (değil operatöre bağlı) kolayca tekrarlanabilir ve kıt hücre artıkları vermektedir yöntem) ve çok az multinucleates (geniş doku manipülasyon 1,2 bir sonucu olarak oluşturmak için açıklanan işlem edilmiştir). Ayrıca, enzimatik işlemlerin aksine, bu makromoleküllerin bozulması lehine olabilir RNases, Tripsin ve kolajenaz, kullanımı önler.
Öte yandan, her ne kadar daha önceki raporlarda sadece mekanik bir yöntemle hazırlandı, testis hücre süspansiyonlarının tripsinize daha kolay külçeleşmişti işaret etmektedir sahadaes 1, mevcut yöntemin uygulaması Şekil 1'de görülebileceği gibi, çok az hücre süspansiyonlarında topaklanma işlenir. Bu anlamda, biz hücre topaklanma önlenmesi ve sonraki akım çalışmaları sırasında tıkanma meme kaçınarak NDA dahil çok etkili bulduk. Şekil 1 de Şekil 2'de gösterilen FC histogramlar da açıktır hücre artıkları azlığı, ortaya koymaktadır.
Bunun yanı sıra, bu yöntem ile hazırlanmış hücre süspansiyonları, testis farklı hücre tipleri arasında yeterli bir temsilini göstermektedir. Bu Seminifer tübüllerin kesitlerde hücre sayımı bildirilen veriler Burada yer alan yöntem ile hazırlanabilir testis hücre süspansiyonları, hücre bileşimi karşılaştırarak sonucuna ve hücre süspansiyonları ile hem de diğer yöntemleri (Tablo 1) kullanarak hazırlandı.
FC histogramlar prese tarafından hazırlanan süspansiyonlar için eldent protokolü ve Hoechst 33.342 (Şekil 2A) veya PI (Şekil 2B) ile de boyandı ölçüde de işlem seçici herhangi bir hücre tipi zarar vermez varsayımı destekleyen, daha önce bildirilen olanlar 8 farklı değildir.
| DNA içeriğine göre Testis hücre tipleri | Bozulmamış testis, bir (%) | Medimachine - hazırlanan süspansiyonlar b (%) | Bir (%) tripsinize süspansiyonlar |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| Diğer | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| Hücre sayıları mikroskobik gözlem ile değerlendirildi. b Hücre sayımları akış sitometri ile değerlendirildi. | |||
Tablo 1. Fare - için - fare (A) ve sağlam testis ve kıyasla burada sunulan yöntem ile hazırlanabilir kobay (B), hücre süspansiyonları için kendi DNA içeriği açısından farklılık gösteren erişkin testis hücre popülasyonlarının görece yüzdeleri, t(Geisinger ve Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet gelen Modifiye. Genom Res. 128, 46 (2010)) o tripsin hazırlanmış süspansiyonlar. DNA içeriği: C (yuvarlak ve uzayan spermatid, sperm), 2C (testis somatik hücre, spermatogonia, ikincil spermatosit) ve 4C (birincil spermatosit ve G2 aşamasında birkaç çoğalan spermatogonia).
Şekil 1. İşbu Protokol tarafından hazırlanan ve faz kontrast mikroskobu ile görüntülendi yetişkin sıçan testis bir hücre süspansiyonu kısmi görünümü. Görüldüğü gibi, hücre sitoplazmalarında oldukça iyi korunmuştur. Çubuk 25 um karşılık gelir. Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol çoğaltılamaz. Proced. Çevrimiçi. 11, 184 (2009).
Şekil 2. Yetişkin sıçan, fare, kobay ve hayati boya Hoechst 33.342 (A) veya PI ile (B) ile boyanmış 21 gün postpartum (dpp) sıçan yavrular, gelen gelen testis hücre süspansiyonları FC DNA içerik analizi. Tüm durumlarda C, 2C ve 4C hücre popülasyonlarının kolay hem de boyalar, hem de C nüfusun sola görünüşte alt haploid zirve ile elde histogramlarda da tarif edilebilir. Bu ikinci pik kendi özet kromatin durumuna bağlı olarak 12 ayrı, daha az lekeli alt-populasyon görünür sperm ihtiva ettiği gösterilmiştir. Tüm grafik enkaz azlığı dikkat edin. Bu Spermatidler ve sperm eksikliği 21 dpp (çocuk örnekleri) profilleri, özellikle belirgindir. Geisinger ve Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet değiştirilmiş. Genom Res. 128, 46 (2010). büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. 4C hücre popülasyonu yetişkin farenin bir testiküler hücre süspansiyonu sınıflandırılmaktadır. Sıralanmıştır hücreleri temiz poli-L-lisin ile tedavi edilen slaytlar üzerine yatırılır ve Giemsa boyama (B) sonra faz-kontrast mikroskobu (A) ya da parlak bir alan altında gözlenmiştir. Bar = 20 mikron. Geisinger ve Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet çoğaltılamaz. Genom Res. 128, 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. Protokol ile hazırlanan bir yetişkin kobay testiküler hücre süspansiyonu, Şekil 4 A), FC analiz Burada tarif edildiği gibi (a), çubuk;. (B), nokta arsa. 4C hücre popülasyonunun iki alt grupları not edin. Kriteri 4C R3 hücreleri (a, b) ve R4, (A ', B') bölgelerinin B) analizi. (A, a '), Epifloresans mikroskobu görüntülerinden PI boyalı hücrelerin . R3 bölgeden çekirdekleri nispeten daha küçük olduğunu unutmayın. Bar: 10 um (B, B '), Sycp3 karşı bir antikor kullanılarak yayılma hücreleri üzerinde immünositokimyasal reaksiyonlar lazer konfokal mikroskopi (synaptonemal kompleks [SC] 3 protein, bir yan eleman bileşeni).. R4 pachytene meiocytes içerirken resim com, R3 kesir basit eksen ve AVM kısa uzanıyor görülebilen erken (lepto / zigoten) meiocytes, karşılık gelen sonuç verirmen AVM toplandı. Rodríguez-Casuriaga, et al., Cytometry değiştirilmiş bir. 79, 625 (2011). büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Spermatogenik akış kriteri hücre fraksiyonlarının 2C, R3 ve R4, (bu son iki fraksiyon ile ilgili bir açıklama Şekil 4 ise) elde edilen toplam RNA A), agaroz jel elektroforez. Hücre süspansiyonları burada tarif edilen protokol ile hazırlanmıştır. Denatüre B) Autoradiogram kiti primer kombinasyonları biri için, "mRNA diferansiyel ekran" yöntemi (GenHunter A.Ş., Nashville, TN RNAimage) ile elde edilen diferansiyel cDNA bantları gösteren poliakrilamid jel elektroforez. aynı üç hücre popülasyonlarının ikinci mRNA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem gerektiğinde önemlidir kısa yaşam makromoleküllerin iyi korunması, hesap olacaktır.
PI veya Hoechst 33.342 birinin kullanımı ile ilgili olarak, biz bir veya diğer boya istihdam ile testis hücre süspansiyonları akış sitometrik analizi kaynaklanan profillerinde belirgin farklılıklar gözlemledik. Boya seçimi oldukça kullanıcının tercihleri ve mevcutların bağlıdır, ve olacaktırplanlanan daha kullanımı. Bir tarafta, PI ucuz ve yaygın uygulama olarak akış sitometrelerinde ve bir UV lazerin sorters kullanımını gerektirmez. Öte yandan, başarılı düşük sitotoksik seviyeleri ile açığa vurulmamış sıralama ve diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları (Şekil 4), Hoechst 33.342 veya başka bir hayati boya için PI-boyanan hücrelerin kullanmış olsa da, tam hücre canlılığı gerektiği uygulamalar için tercih edilen seçenek olabilir germ hücre kültürü ve / veya transplantasyon 4 gibi.
Biz, hatta aynı DNA içeriği ancak farklı kromatin yoğunlaşması düzeyleri (Şekil 4) ile alt grupları için farklı DNA içeriği 4 (Şekil 3) ile seçilen testis nüfus için ya 95 üzerinde% saflıkta elde belirli hücre popülasyonlarının sıralamak mümkün olmuştur. Ilgi alt popülasyonlar sitometrik profillerde bireysel olabilir gibi bu ikinci pa, sürece yapılabilirrticularly nokta parsellerde. Örneğin, bugüne kadar biz kobay meiocytes Ben 9 farklı aşamalarında sıralamak mümkün olmuştur, ama sadece DNA boyama tarafından 2C nüfus içinde alt grupları ayrımcılık ve sıralamak için değil. Sıralanmış hücreleri aşağı diferansiyel gen ekspresyon analizleri 9 (Şekil 5) sağlayan, kaliteli RNA hale getirmiştir.
Protokol açıklama görülebileceği gibi, kolayca üretilebilir, çok basit ve özellikle kalifiye personel gerektirmez. Biz akım sitometri ya da içeren geniş bir uygulama çeşitli kabul edilebilir düşünün. Spermatogenik önceden hızlı bir şekilde kontrol etmek için basit testis içerik analizi, hazırlık ile başkalarına eski dizi burada gösterildiği gibi, bu gizli moleküler çalışmalar için özel hücre popülasyonlarının akışı arıtma olarak hedeflemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen CSIC (I + D proje C022) ve PEDECIBA tarafından desteklenmiştir. Yazarlar yavaşça bu projede kullanılan tüm kobay örnekler sağlamak için MoFlo hücre sıralayıcı ve Merial-Montevideo ile ilgili cömert işbirliği için Hücre Biyolojisi Birimi (Institut Pasteur de Montevideo) den Mariela Bollati ve Valentina Porro teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1 Şekil 2 ve 3, ve S. Karger AG, Basel izni ile Tablo 1,, BioMed Central izni ile yeniden ve Şekil 4 ve 5 John Wiley & Sons, Inc (ait telif hakkı izni ile çoğaltılamaz veya uyarlandı Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
